黄芪甲苷促进脐带血干细胞…….docVIP

PAGE PAGE 1 黄芪甲苷促进脐带血干细胞…… 福建……医院…科（福州 3500031）廖… 江… 【摘 要】 目的 探讨黄芪甲苷对脐带血……的作用。方法 采用贴壁法分离人脐带血间充质干细胞，用流式细胞术对细胞表型进行鉴定。通过免疫组化方法观察黄芪甲苷对间充质干细胞向心肌细胞分化的促进作用。结果 流式细胞仪检测结果表明，分离的脐带血间充质干细胞表达CD29、CD44和CD105，不表达CD34和HLA-DR。黄芪甲苷（浓度200 mg/L)作用下，间充质干细胞表达特异性心肌细胞蛋白，包括结蛋白（desmin）、α横纹肌肌动蛋白（α-sarcomeric actin）和肌钙蛋白T(C-TnT)。结论 黄芪甲苷对脐带血间充质干细胞分化…… 【关键词】 黄芪甲苷；间充质干细胞；心肌细胞 【中图分类号】R 【文献标识码】B 【文章编号】1002-2600(2011)01 急性心肌梗塞是严重的心血管疾病，患者部分心肌因严重而持久的缺血发生局部坏死，从而导致心脏功能的严重损害。对于终末期的心功能不全患者，……。短短的几年，心肌梗塞的间充质干细胞（Mesenchymal stem cell,MSC）治疗即从动物试验过渡到临床[1-3]。研究表明，MSC可以从骨髓、脐血、外周血、皮肤、脂肪等多种组织中分离获得；但从取材的方便程度、细胞的免疫原性和增殖分化能力等多方面综合考虑，脐血作为MSC的来源具有很大的优势。尤其是心梗患者，骨髓采集比较困难。本研究采用贴壁法分离脐带血MSC，并探索黄芪甲苷对其向心肌细胞分化的影响。 材料与方法 1.1 试验试剂:淋巴细胞分离液（浓度1.077 g/ml），购自中科院天津血液病研究所…… 培养基，购自Sigma公司……。胎牛血清，购自杭州四季青生物工程材料有限公司。0.25% 胰蛋白酶/0.02%乙二胺四乙酸（EDTA），购自Gibico公司。各种抗体购自武汉博士德生物技术有限公司。黄芪甲苷购自中检所。D-Hank`S液自配（称NaCl 8 g，KCl 0.40g，Na2HPO4·H2O 0.06 g， KH2PO4 0.06 g， NaHCO3 0.35 g，酚红0.02 g，加超纯水至1 000 ml，充分溶解后，用NaHCO3溶液 调节pH至7.2～7.4，0.22 1.2 方法 1.2.1 脐血标本的采集：参照文献报道的方法[6]。脐血标本来自于健康足月顺产或剖宫产新生儿，产妇产前检查均正常。脐血的收集均已征得产妇同意。待胎儿娩出后，……用注射器穿刺脐静脉抽取脐血，加入含有肝素（20 U/ml）的生理盐水瓶中，充分混匀。脐血采集后4 h 1.2.2 脐血单个核细胞的分离和培养:采用密度梯度离心法。取50ml的无菌带盖离心管，加入1.077 基金项目：福建省自然科学基金资助项目(2006J0106) g/cm3的淋巴细胞分离液25 ml。离液面约1 cm处缓慢加入脐血25 ml，形成一明显的界面。2 000 rpm离心20 min后吸取中间的白膜层。加入5倍体积的磷酸缓冲液（PBS），1 000 rpm×10 min离心洗涤3次。所得单个核细胞经计数板计数后，调整至1.0×10 1.2.3 MSC的培养:从脐血中分离出的单个核细胞以1.0×106 /ml的密度接种于DMEM-LG培养基（含20%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素），置于37℃、5%CO2和饱和湿度的CO2培养箱中培养。每隔5天换液一次，待细胞出现融合后每3天换液1 1.2.4 MSC的表面抗原检测:采用流式细胞仪检测。选择第3代细胞，待细胞生长达到90%以上融合后，PBS轻洗2次，0.25%胰酶/0.02%EDTA消化。1000rpm×5min离心洗涤3次，然后用PBS洗液（PBS+1%胎牛血清）重悬并调整细胞浓度为2×106/ml。取100μl待测细胞，分别加入10 μl异硫氰酸荧光素 (FITC)或藻红蛋白（phycoerythrin,PE）标记的抗体（CD29-FITC，CD44-FITC，CD105-PE，CD34-FITC，HLA-DR-PE，相应的同型对照分别为IgG1-FITC，IgG2α-FITC，IgG2α-PE，IgG1-FITC和IgG1-PE），混匀，室温避光孵育20 min，上流式细胞仪检测。 1.2.5 干细胞的分化诱导:参考文献报道的方法[7]，将MSC以5×103/ml的密度接种于放置有消毒盖玻片的6孔板内，制备细胞爬片。每孔加入2 ml培养基，内含黄芪甲苷(终末浓度为20和200 mg/L)。对照组只加培养液。每3天换一次培养基。3周后吸出培养基，小心加入磷酸缓冲液轻轻冲洗