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* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 34个循环 3. 电泳、观察 94℃ 4 min (预变性) 94℃ 30 sec Tm 30 sec 72℃ 0.5-2 min 72℃ 10 min 五、作业 PCR反应液中主要成分是哪些？在PCR反应过程中各起什么作用？ 为什么在PCR反应过程中，使用三个不同的温度变化？ PCR 扩增对引物有什么要求？为什么？ 实验五 大肠杆菌感受态细胞制备 一、实验目的 了解感受态大肠杆菌发生的原理 掌握感受态大肠杆菌化学制备技术 二、实验材料和用品 恒温摇床、电热恒温培养箱、台式高速离心机、超净工作台、低温冰箱、水浴锅、 制冰机、分光光度计等 实验仪器设备： 试剂： LB固体和液体培养基、氨苄青霉素(Amp)、CaCl2溶液、甘油等 E. coli DH5α或者JM 109菌株 实验材料： 三、实验原理 感受态制备原理： 细菌细胞经过一些特殊方法【如电击法、或者CaCl2、RbCl、KCl 等化学试剂法】处理，细胞膜的通透性发生了暂时性改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。 四、实验步骤 受体菌的培养 1. 划LB平板， 37℃培养过夜；挑单克隆，接种于3ml LB液体培养基，37℃振荡培养过夜； 2. 将该菌悬液以1:50-100比例接种于200ml LB液体培养基，37 ℃振荡培养至OD 600 =0.5 感受态细胞制备( CaCl2 法) 3. 将培养液转入离心管中，冰上放置10min，离心：4℃，3000g，10 min ； 4. 弃上清，加预冷 CaCl2 溶液10ml，轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30分钟后，离心：4℃，3000g，10 min； 5. 弃上清，加10 ml预冷含15%甘油的CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟； 6. 分装成100μl的小份，-70℃保存。 五、作业 制备感受态细胞的原理是什么？ 实验六 质粒转化 一、实验目的 学习质粒转化的基本原理和方法 了解阳性克隆筛选的原理和技术 二、实验材料和用品 灭菌锅、移液器、水浴锅、超净工作台、离心机、恒温摇床、培养箱等 实验仪器设备： 试剂： LB液体培养基、LB固体培养平板等 质粒和感受态大肠杆菌JM 109 实验材料： 三、实验原理 质粒转化原理： 感受态的大肠杆菌细胞膜通透性暂时增加，质粒DNA在热激作用下透过细胞膜，进入细菌内，再在正常的培养条件下借助细菌的繁殖而扩增这些质粒DNA 某些质粒带有大肠杆菌半乳糖苷酶基因，在该基因区外引入了一段含多种单一限制酶位点的DNA序列。如果无外源DNA片段，质粒被导入lac-的大肠杆菌后，质粒携带的半乳糖苷酶基因将正常表达，产生有活性的半乳糖苷酶，加入人工底物X-gal和诱导剂IPTG后，出现蓝色的菌落。反之如果插入外源DNA片段，将使lac Z基因灭活，不能生成半乳糖苷酶，结果菌落出现白色。 克隆蓝白筛选的原理： 四、实验步骤 DNA的提取 1. 从低温冰箱中取100μl感受态细胞悬液，冰上解冻； 2. 加入质粒DNA (含量不超过50ng,体积不超过10μl) ，冰上放置30分钟； 3. 42℃静止水浴90秒，冰上冷却3-5 min； 4. 加1ml LB液体培养基(不含Amp)，37℃振荡培养1小时进行复苏，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr ) ； 5. 离心：室温，3000g，2min，吸出0.8ml； 6. 取100μl 涂布含Amp的LB平板上，放置半小时后倒置，37℃培养16-24小时。 五、作业 如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落,你将如何解释这种现象？ 试说明蓝白筛选的原理？ 实验七 钙调蛋白提取与聚丙烯酰胺凝胶电泳 一、实验目的 了解钙调蛋白提取的基本原理和技术 掌握蛋白质染色和脱色技术 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理和技术 二、实验材料和用品 冰箱、冷冻离心机、匀浆器、垂直电泳系统、脱色摇床、凝胶成像系统等 实验仪器设备： 试 剂： 2-巯基乙醇、缓冲液H(10x)、30%（W/V）凝胶贮存液、Tris-HCL（PH8.8）、Tris-HCL（PH6.7）、10%SDS、10%过硫酸铵、TEMED(四甲基已二铵) 、10x Tris甘氨酸电泳缓冲液（PH8.3）、10x 样品处理液、考马斯亮蓝染色液、脱色液等 三、实验原理 钙调蛋白分离原理： 鸡胗平滑肌无结构上相关的肌钙蛋白C，血管、脂肪和结缔组织含量低，影响制备的相关蛋白很少。