灰霉菌糖异生限速酶PEPCK基因的致病功能的研究.pdfVIP

中文摘要 糖异生是生物体将如乳酸、丙酮酸、甘油等多种非糖物质转变成糖葡萄糖或 糖原的过程，也是一种几乎所有生物营养饥饿胁迫的生存机制，对其生长发育、 分化乃至生存都是至关重要。通过筛选灰霉菌 T-DNA 突变体库中致病性衰弱的突 变体，我们获得了一株致病性致弱的突变体，经热不对称 RCR （Tail-PCR）及所 获序列分析发现 T-DNA 插入灰霉菌基因组中糖异生的第二个关键酶 PEPCK 基因 导致了该病原菌致病性的致弱。我们将灰霉菌中 PEPCK 基因命名为 BcPCK，并通 过基因敲除等遗传操作获得了BcPCK 基因的缺失突变体 （Bcpck ）的及其互补 菌株。通过对这些灰霉菌野生型（B05.10）、BcPCK 基因敲除突变体(Bcpck)及 其遗传互补转化 (Bcpck-C)菌株的营养及致病性发育研究，我们发现：在营养丰 富的培养基（CM）中，Bcpck 的生长与野生型和互补转菌株没有显著差异，但 在缺乏葡萄糖、蔗糖或糖异生底物如甘油、生糖氨基酸等营养匮乏的培养基中、 Bcpck 生长极其缓慢甚至不能生长。在营养丰富的培养基中，Bcpck 的产孢、 菌核形成也严重受损。此外，Bcpck 的大多数分生孢子失去形成侵染结构附着 胞的能力，其侵染垫的形成也滞后 8-12 小时，侵染垫的大小（成熟度）明显小 于相应的野生型和互补菌株。致病性分析结果表明Bcpck 对寄主植物的毒力大 大受损，与其形成附着胞和侵染垫的减少是一致的。这些结果表明，BcPCK 对于 灰霉菌营养和致病生长发育及致病力是具有至关重要的作用。 关键词：灰霉菌；糖异生；PEPCK；营养和致病生长发育；致病性 I Abstract Gluconeogenesis (GNG), a metabolic process that generates glucose or glycogen from non-carbohydrate carbon substrates such as lactate, pyruvic acid, glycerol, and glucogenic amino acids, plays a crucial role in organism adaptation to nutrient starvation, growth and development, differentiation and even survival. However, a role of GNG in pathogenic microorganism pathogenic development and virulence remains obscure. Here, we demonstrate that phosphoenolpyruvate (PEP) carboxykinase gene (PEP CK), a gene encoding the second rate-limiting enzyme of the GNG pathway, plays important roles in these events. We identified a T-DNA tagged mutant that displayed dramatic reduction in pathogenicity via screening for virulence-attenuated mutants from a T-DNA tagged Botrytis cinerea, the causal agent of plant gray mold, mutant library containing about 50,000 transformants. Thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR), sequence and pathogenicity analyses demonstrated that the PEP CK gene was responsible for the pathogenicity reduction of the T-DNA tagged mutant. The gene wa