家族性高胆固醇血症患者低密度脂蛋白受体基因的功能研究-病理学与病理生理学专业论文.docxVIP

y y 605,?,78 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的 地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包 含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共 同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签名：．麻增 日期： 抽1年，月／ 日 关于学位论文使用授权说明 本人同意南华大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅：学校可以公布学位论 文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保留学位论文； 学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。 名：藤髫翩躲尸侈参吼础年t月 廉馨 廉馨 南华大学硕士学位论文 家族性高胆固醇血症患者低密度脂蛋白受体 基因的功能研究 中 文 摘 要 旧的] 家族性高胆固醇血症(familial hypereholesterolemia，FH)是一种常见的常染 色体单基因显性遗传性疾病，是导致动脉粥样硬化和早发冠心病的最重要危险因 素。为探讨FH患者低密度脂蛋白受体(10w density lipoprotein-Receptor，LDL-R) 的功能特点和可能的致病基因、研究FH患者LDL-R结合活性与临床表型之间的 可能关系，本课题拟对一例经临床诊断为FH纯合子的先证者及其家系的全部成 员进行了血脂和临床检测分析，分析先证者及其双亲LDL-R基因mRNA水平及 蛋白表达，建立简便的淋巴细胞表面LDL-R结合与摄取LDL活性的检验方法， 同时对家系成员LDL-R基因外显子和ApoBl00基因进行了序列分析，以检测该 基因是否存在突变。 【方法】 以一例临床诊断为FH纯合的先证者及其家系为研究对象，进行常规体格检 查，血脂等生化指标的测定，并对先证者及其父母进行了心血管超声等进一步的 检查；分离培养先证者及父母的外周血淋巴细胞，以含10％无脂血清(Lipoprotein deficiency serum，LPDS)的1640培养基诱导其LDL-R的最大活性后，加入异硫 氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的LDL，分别于4C和37℃ 孵育2小时，采用流式细胞仪检测其细胞表面结合、摄取LDL的平均荧光强度， 采用激光共聚焦显微镜观察淋巴细胞结合与摄取LDL的情况；免疫细胞化学法检 测了先证者及双亲淋巴细胞表面LDL-R蛋白表达，RT--PCR法检测mRNA的水 平；运用PCR结合直接测序法检测了ApoBl00基因3500附近位点；扩增LDL-R 基因启动子及全部外显子21个片段，变性高效液相色谱(tie-naturing high performance liquid chromat0孕印hy，DHPLC)技术分析PCR扩增产物，对差异峰 型的PCR产物直接测序，与GenBank比对分析突变位点和性质。 廉馨 廉馨 南华大学硕士学位论文 [结果】 FH先证者腕、肘、膝、臀部和眼睑等身体多处可见明显的黄色瘤，双眼均可 见到角膜弓；抽血化验发现血清总胆固醇(Total Cholesterol，TC)水平显著增高， 达15．8mmol／l，低密度脂蛋白胆固醇(LowdensitylipoproteinCholesterol，LDL-C) 为14．4mmom；双侧颈动脉轻度狭窄(直径狭窄35％．45％)，右侧颈总动脉小斑 块形成，左侧股总动脉内膜略增厚。采集该FH家系并绘制家系图，家系中诊断 为可疑FH杂合予的共有18人，其中半数以上(9人)为先证者的直系亲属。其 家系图特点符合常染色体显性遗传性疾病遗传规律。 流式细胞仪检测结果显示，先证者、其父、母4C时淋巴细胞结合FITC-LDL 与正常对照相比均明显降低，荧光强度分别为正常对照的13．6％、33．0％和32．2％； 37℃时淋巴细胞蓄积量分别为正常对照的47．8％、47．8％、40．8％，提示先证者 及其父母淋巴细胞对LDL的结合及摄取功能存在缺陷。激光共聚焦显微镜观察到 4℃反应时，与正常对照相比，FI-I纯合先证者与其杂合父母细胞表面结合 FITC．LDL绿色荧光有不同程度的减弱，也提示其淋巴细胞表面LDL-R的配体结 合功能可能存在障碍；37℃反应2小时后，经LPDS诱导的正常人淋巴细胞内摄 取了大量的FITC．LDL，细胞内可见明显的绿色荧光颗粒，而先证者细胞内摄取 的FITC．LDL的量极少，其父母摄取的LDL量较先证者多，而与正常人比较也明 显减少，也提示先证者及其父母淋巴细胞摄取的FITC-LDL能力减弱。 免疫细胞化学(SABC法)方法检测先证者及其父母淋巴细胞表面LDL-R的 蛋白表达，结果