家蚕三磷酸腺苷结合盒转运子的鉴定及部分成员的克隆与功能分析-特种经济动物饲养专业论文.docxVIP

摘 摘 要 I I 摘 要 三磷酸腺苷结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette, ABC)广泛分布于从细菌到人类 等各种生物体中，是最大的膜蛋白家族之一，它主要利用 ATP 水解释放能量实现多种 底物的跨膜转运。ABC 转运子在生物体内以全分子或半分子转运子的形式存在，全分 子转运子由 2 个核苷酸结合域(nucleotide binding domain，NBD) 和 2 个跨膜结构域 (transmembrane domain，TMD)构成，每个半分子转运子包括 1 个 NBD 和 1 个 TMD， 每个 TMD 一般由 6 个 α 螺旋构成，半分子转运子依赖形成同源或异源二聚体发挥作 用，它们通过形成一个跨膜通道以实现底物分子的跨膜运输。利用生物信息学知识， 本文初步鉴别了家蚕基因组数据库中潜在的 47 个 ABC 转运蛋白，这些蛋白成员涵盖 了 ABC 转运蛋白的 8 个亚族(ABCA-ABCH)。家蚕 ABCC 亚族是含有成员最多的亚族， 有 15 个成员，其中有 5 个同源于果蝇的的多药耐药糖蛋白(multidrug resistance，MDR)； ABCB 亚族有 9 个成员，有 4 个与果蝇的多药耐药相关蛋白 (multidrug resistance-associated proteins，MRPs)同源。目前，家蚕 ABC 转运蛋白研究相对较少， 通过对家蚕 ABC 转运蛋白的初步鉴定，为进一步研究家蚕 ABC 转运蛋白的功能提供 了条件。 三磷酸腺苷结合盒转运子 B 亚族成员 ABCB6 (ATP-binding cassette transporter isoform B6, ABCB6)是一个非常重要的半分子转运子，在哺乳动物中主要参与细胞内卟 啉类化合物的转运和铁离子平衡的调节。利用人的 ABCB6 基因编码氨基酸序列在家蚕 EST 数据库中进行 tblastn 检索，把检索到的 EST 序列进行电子拼接，根据拼接结果 设计引物进行 RT-PCR 扩增、克隆测序验证。通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR) 成功克隆了家蚕 Abcb 亚族基因第 1 个成员 BmAbcb6 的完整开放阅读框。生物信息学 方法分析发现，BmAbcb6 有 16 个外显子和 15 个内含子，编码 850 个氨基酸残基，分 子质量为 96.35 kD，等电点 8.23；BmAbcb6 含有 1 个 NBD 和有 10 个 α 螺旋构成的 TMD，是家蚕 Abcb 亚族成员。半定量 RT-PCR 方法分析 BmAbcb6 在家蚕 5 龄第 3 天 幼虫不同组织中均有表达，其中以精巢中的表达量相对最高。研究结果为进一步研究 该基因的功能奠定了基础。 通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增、克隆测序了家蚕 ABC 转运子 Bmwh2 完整的开放阅读框。生物信息学方法分析发现，Bmwh2 有 14 个外显子和 13 个内含子， 编码 689 个氨基酸残基，分子质量为 77.38 kD，等电点 8.42。Bmwh2 含有 1 个 NBD 和 6 个 α 螺旋构成的 TMD，为半转运子，属于家蚕 ABC 转运子超家族 G 亚族成员。 半定量 RT-PCR 方法分析 Bmwh2 在家蚕 5 龄第 3 天幼虫不同组织的表达水平，以精巢 江苏科技大学农学硕士学位论文 江苏科技大学农学硕士学位论文 Ⅱ Ⅱ 中的表达量相对最高。通过显微注射仪，用合成的 siRNA 注射胚胎发育时期的蚕卵， 对 Bmwh2 进行干涉研究，获得了白卵和嵌合体的干涉表型。根据实验结果，推测 Bmwh2 参与家蚕浆液膜色素前体的转运。 关键词 家蚕; 三磷酸腺苷结合盒转运子; B 亚族基因; 组织表达; Bmwh2; siRNA; 色素 Abs Abstract PAGE PAGE IV Abstract ATP-binding cassette (ABC) transporter proteins constitute one of the largest protein superfamilies and are present in all organisms from bacteria to human. These proteins utilize the energy derived from ATP binding hydrolysis to drive substrate translocation across the membrane. ABC transporters have been subdivided into either full or half transporters in all organ