利用CRISPRCas9n技术生产抗蓝耳病的基因编辑克隆猪.PDFVIP

浙江大学学报（农业与生命科学版） 44（2）：157～161，2018 JournalofZhejiangUniversity(Agric.LifeSci.) /agr E-mail:zdxbnsb@ DOI:10.3785/j.issn.1008-9209.2018.03.013 利用CRISPR/Cas9n技术生产抗蓝耳病的基因编辑克隆猪 1 1 1 2 2 2 2 1*1 王少华，赵盼盼 ，刘通，丁彪，罗磊，曹祖兵，张运海，张坤 （1.浙江大学动物科学学院，哺乳动物分子胚胎学实验室，杭州310058 ；2.安徽农业大学动物科技学院，合肥230036 ） 摘要 本研究利用基于CRISPR/Cas9n 系统的基因编辑技术结合体细胞核移植技术，构建了在同一载体中同时表 达2 条sgRNA 和Cas9 切刻酶以及绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP ）的质粒，瞬时转染猪的成纤维细 胞。通过流式细胞仪分选获得表达GFP 的细胞，继续培养GFP 阳性细胞至单个细胞长成细胞克隆点，经聚合酶链 式反应（polymerase chain reaction, PCR ）和DNA 测序鉴定获得了对CD163 基因进行编辑的细胞克隆点，阳性率高 达90%（18/20 ）。以CD163 基因编辑的细胞为供体细胞进行体细胞克隆和胚胎移植，获得了2 头正常存活的CD163 基因编辑猪。 关键词 CRISPR/Cas9n 系统；基因编辑；蓝耳病；CD163 基因 中图分类号 Q 78 ；S 828 文献标志码 A Production of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)-resistant genome- edited cloned pigs using CRISPR/Cas9n system. Journal of Zhejiang University (Agric. Life Sci.) , 2018, 44(2): 157-161 1 1 1 2 2 2 2 WANG Shaohua , ZHAO Panpan , LIU Tong , DING Biao , LUO Lei , CAO Zubing , ZHANG Yunhai , ZHANG Kun1* (1. Laboratory of Mammalian Molecular Embryology, College of Animal Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China; 2. College of Animal Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China) Abstract Using gene editing technology based on CRISPR/Cas9n system and somatic cell nuclear transfer technology, we constructed a plasmid of two sgRNAs and Cas9 nickase, and green fluorescent protein (GFP) in the same vector followed by transient transfection of porcine fibroblasts. By flow cytometry, the cells expr