霍乱肠毒素B亚单位在转基因番茄果实中特异性表达的研究-流行病学专业论文.docxVIP

群壬擎拉静t原创性声明 群壬擎拉静t 原创性声明 本人郑重声明，所呈交的学位论文，是本人在导师的指导 下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的 内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过 的作品成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已 在文中已明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由 本人承担。 学位论文作者签名：江晓玲 日期：2003年6月3日 博士学位论主常用英文缩写词表 博士学位论主 常用英文缩写词表 6 缚士学拉论文摘 缚士学拉论文 摘 要 霍乱是由霍乱弧菌引起的一种急性肠道传染病，由于发病急、传播 快、波及面广、危害极为严重，因此其预防和控制受到各国政府的高度 重视。在一些经济欠发达、卫生条件较差的地区，预防接种是进行霍乱 防治较为有效的措施，但现有疫苗费用昂贵，贮存、运输相当困难，因 此，研制成本低、使用简单、易于贮存运输的新疫苗是当前疫苗研究的 一大热点。 植物基因工程技术的不断成熟为新型疫苗的研究提供了新的思路。 转基因植物产生的疫苗，可由人体简单摄食含该种疫苗的植物组织，通 过刺激机体粘膜的特异性免疫应答，使人体获得较持久的‘疾病防御能 力。由于成本低廉、无需冷藏、无需一次性针头、使用方便，因此， “植物口服疫苗”得到了世界卫生组织(唧)的提倡，开展这方面的研 究对推动全球免疫计划的实旖具有重要的意义。 本研究利用植物DNA重组技术，培育出只在番茄果实中特异、高效 表达霍乱毒紊B亚单位(CTB)的植物口服疫苗，为霍乱弧菌植物口服疫 苗的应用研究及市场化提供实验基础。 首先，我们通过酶切、PCR等方法分别获取目的基因CTB和番茄果 实特异性启动子一一E8启动子基因片段，利用质粒pBlueScript(+) sK、T载体和PBll21上的酶切位点，构建启动子为E8的植物双元表达 载体Pe8一CTB，以冻融法将其转至根癌农杆菌LBA4404中。 再通过正交设计实验，以番茄子叶为外植体，对所选用的番茄品 种、子叶苗龄、植物激素浓度和培养温度等条件进行优化，结果表明， 当选用穗丰品种、培养温度为27±1℃、BA=3．0 mg／L、IAA=O．1mgm 芹壬学盛碚_之对，芽的再生频率平均高达98，5％，每片子叶外植体的平均再生芽数达 芹壬学盛碚_之 对，芽的再生频率平均高达98，5％，每片子叶外植体的平均再生芽数达 6，8个。 在高效再生系统的基础上，优化农杆菌稀释浓度、浸染时间和转化 方式等条件。在子叶预培养2d、活化农杆菌稀释倍数约30倍、侵染时 间为lOmin的情况下，子叶存活时间最长，抗性芽产生频率达25％。在 此条件下，将CTB基因通过农杆菌浸染法对番茄细胞进行转化，筛选到 30株抗性番茄幼芽。对这些抗性芽作伸长、生根诱导培养，其中26株 长成番茄植株并开花结果。 对植物基因组DNA的PCR、dot blot和Southern印迹杂交，证实 所获得的26株抗性植株中14株有CTB整合到番茄基鼠组DNA中。 提取转基因番茄植袜不同部位组织、不同时期果实总的可溶性蛋 白，进行ELISA检测和western blot杂交，结果表明其中2株的番茄 果实有CTB的表达，表达量随着果实的成熟而升高，并在完全成熟果实 中达到最高(455ng／g鲜重和385ng／g鲜重)，达到了当前国际上所报 道的外源基因在番茄中表达的较高水平。 动物喂饲实验研究正在进行中。 关键词：霍乱肠毒素B亚单位，转基因植物，番茄，E8启动子 缚士学位论文Studies 缚士学位论文 Studies on The Fruit—’specific Expression of Cholera Toxin B in Transgenic Tomato Plants Abstract There is an increasing world demand for cheap vaccines that can be readily administered to the population，especially in many undeveloped regions． Since oral immunization could successfully induce specific sIgA responses and systemic immune reactions，plant—based vaccine become a very promising strategy because of its special characteristic such as cheap． easy to produce，store and apply．One hurdle before the development of