甲醛对类香草素受体的激活作用和甲醛诱导型哮喘分子机理的研究-生物化学及分子生物学专业论文.docxVIP

硕士学位论文MASTER’S丁IIESIS 硕士学位论文 MASTER’S丁IIESIS 中文摘要 近年来，关于室内空气甲醛污染与人体健康效应的研究日益广泛深入。甲醛引 起的气道神经源性炎症、获得性过敏体质现象等生物学效应，都涉及甲醛触发性生 物靶分子介导的病理学过程。1991年丹麦学者G D．Nielsen首先提出假说：室内空 气污染物(如甲醛)所致的气道刺激作用是一种受体介导的病理学过程，这种受体 可能是辣椒素受体，现已证实辣椒素受体即为类香草素受体，它们分布于气道黏膜 中神经末梢的细胞膜上。由于当时和后来对这种膜受体蛋白本质的认识还非常有 限，他所提出的假说一直没有得到科学实验的证实。1997年美国加洲大学David Julius教授课题组首次鉴定并命名了类香草素受体(vanilloid receptor subtype 1， VRl)，他们构建了大鼠感觉神经元VRl重组质粒，并成功地在人胚肾细胞 (HEK-293细胞)和非洲爪蟾卵母细胞(Xenopus laevis oocyte)中表达出VRl膜 蛋白／离子通道，建立了VRl+重组细胞，进行了有关VRl的分子生物学、电生理学 研究，并应用于疼痛传导机制和分子药理学的研究，其多篇研究论文在{Nature)) 和{Science))上发表。VRl+重组细胞的建立为检验和完善Nielsen假说提供了坚实 的物质基础。我们将该受体的研究引入环境医学领域，很可能导致对室内空气污染 与疾病关系分子机理的研究(如甲醛诱导型哮喘)取得重要进展。 本课题就甲醛对VRl的激活作用开展了体外和体内实验研究，阐明甲醛触发性 生物靶分子的作用机理，验证Nielsen假说的正确性；在此基础上开展了甲醛诱导 型哮喘分子机理的实验研究，结果如下： 1．VRl4-HEK293细胞模型的构建和Nielsen假说的验证 为研究VRl作为室内空气污染物的触发性生物靶分子的生理作用，在 VRl．cDNA质粒基础上，应用分子克隆和细胞转染技术构建了体外培养的 VRl-I-HEK293细胞模型，并应用此细胞模型进行辣椒素和甲醛致VRl+．HEK293细 胞死亡实验。结果表明，VRl+．HEK293细胞模型构建成功，VRl+细胞死亡实验是 一种简便有效的鉴定VRl体外表达的实验方法；甲醛能够激活VRl，且激活反应 能被VRI特异性拮抗剂capsazepine所阻断，从而推断甲醛对气道的刺激作用也可 能是通过VRl所介导的。用体外细胞学实验证实了VRl是甲醛作用的生物靶分子， 以实验证实了Nielsen假说的正确性。 ⑧ ⑧ 硕士学位论文 MASTER’S THESIS 2．非洲爪蟾卵母细胞电压钳实验 1997年David Julius教授课题组建立的VRl+细胞模型，将VRl从体内错综复 杂的神经网络系统中游离出来，使得利用体外细胞表达系统对其进行针对性的全面 深入研究成为可能。甲醛是否可以作为配体激活VRl，产生气道刺激作用，通过第 一套VRl信号传递系统(FA／VRl／Ca“／sPnqKR)介导神经源性炎症，通过第二套 VRl信号传递系统(FA／VRl／Ca2+／IL-4flgE)导致机体获得性过敏体质的形成，以及 其他的室内空气污染物，如可吸入颗粒物PM2 5、增塑剂邻苯二甲酸酯(PAEs)等 是否也可以激活VRl，介导上述毒性作用，电压钳实验是最为有力的检验手段。 由于电生理记录是技术难度最大操作最复杂的实验环节，我们首先开展了非洲 爪蟾卵母细胞内源性ATP激活电流的研究。在带有滤泡膜的非洲爪蟾卵母细胞中， 记录到了3种形式的电流，分别是ATP所激活的内源性膜电流(Imp)的3个成 分：快内向电流(early fast depolarizing current，lDl)；较慢的内向电流(1ate slow depolarizingcurrent，ID2)和缓慢的外向电流(slowhygerpolarizingcurrent，IH)。 其结果与李之望教授课题组报道的实验结果一致，说明我们的电生理记录是成功 的。目前我们已完成体外转录、显微注射和卵母细胞离体培养，预期得到VRl”非 洲爪蟾卵母细胞，进行甲醛激活VRl电压钳实验。 3．非致炎浓度的福尔马林激活小鼠皮肤类香草素受体 为探索非致炎浓度的福尔马林对小鼠皮肤类香草素受体(vRl)的激活作用。 我们选用雄性KM小鼠随机分为3组：福尔马林(formalin，FM)组、辣椒素(capsaicin， CAP)组和Capsazepine(CPZ)组。采用注射后5min内小鼠舔舐注射脚掌的时间 作为评价疼痛反应的指标，对各组小鼠分别进行疼痛学观测。结果表明，0．025％FM 和200／Mmol／L CAP是理想的实验浓度，即既能引起显著疼痛反应