南开大学细胞生物学课件11第十一章(2)细胞增殖及其调控-4-6.ppt

1、MPF的发现及其作用 Sunkara等将HeLa细胞同步于细胞周期的不同阶段，制备提取液，用显微注射法注入G2期蛙卵母细胞中，发现可促使G2期细胞进入分裂期。 只有M期细胞提取液具有促分裂活性，而间期细胞提取液却没有促分裂活性，提示M期细胞中可能存在一种促分裂因子。 1971年，Masui和Markert用非洲爪蟾做实验，明确提出MPF（maturation-promoting factor ）概念。 他们用雌性激素孕酮（progesterone）刺激处于meiosis I前期的非洲爪蟾卵母细胞，诱导其成熟（进行减数分裂）。然后将其细胞质注射于到另一个未成熟卵母细胞中，结果诱导后者成熟。再将后者细胞质注射到新的卵母细胞中，新的卵母细胞仍被诱导成熟。 他们认为，在成熟的卵细胞的细胞质中，必然有一种物质，可以诱导卵母细胞成熟。他们将此种物质称为促成熟因子，即MPF 。 用孕酮诱导卵母细胞成熟，卵母细胞需要进行蛋白质合成。而用成熟卵细胞的细胞质诱导卵母细胞成熟，则不需要蛋白质合成。这些结果表明，在成熟卵母细胞中，MPF已经存在，但无活性，称为前体MPF (preMPF)，通过翻译后修饰，可以转化为有活性的MPF。 1988年，Maller实验室从非洲爪蟾卵中分离出MPF，并证明其含有两种蛋白，二者结合后有蛋白激酶（kinase）活性。 Hunt等在海胆卵细胞中发现两种特殊蛋白质，含量随细胞周期进程变化而变化，命名为细胞周期蛋白(cyclin)。根据它们序列上的细微差别分为cyclin A和cyclin B。 Maller实验室与Nurse实验室合作，发现p34cdc2激酶为MPF的一个主要成分。 Maller实验室与Hunt实验室合作，发现cyclin B为MPF的另一个主要成分。 周期蛋白家族成员在动物中包括cyclin A1、A2、B1、B2、B3、C、D1、D2、D3、E1、E2、F、G、H等，在酵母中包括Cln1~Cln3、Clb1~Clb6等。 各种周期蛋白在细胞周期内表达的时期不同，所执行的功能也不同。 各种周期蛋白有着共同的分子结构特点，但也各有特性。 各种周期蛋白在细胞周期中表达的时期不同。 Cdk激酶抑制蛋白 Cdk激酶抑制蛋白（Cdk inhibitor，CKI）对Cdk激酶活性其负性调控，分为CIP/KIP家族和INK4家族两类。 五、细胞周期调控II 1、G1期/S期转换的调控 Rb对G1/S的调控 Kundson对视网膜母细胞瘤（retinoblastoma, RB)研究时，发现该肿瘤的形成需要第13号染色体上（13q14.2）一对等位基因的同时缺失或失活，表明该基因具有抑制肿瘤形成的作用，称为Rb基因（人 200kb, 转录物4.7kb）。Rb蛋白具有多种转录因子的结合位点，如E2F、A1F、RBF1。 p53对G1/S的调控 p53是一个肿瘤抑制蛋白，其基因定位于17p13.1，该基因的突变与50%的人类肿瘤相关。 UV、药物等引起的DNA损伤会激活细胞内的ATM等激酶，导致p53的激活，阻止细胞周期进程，直到DNA损伤完全修复。如果最终不能完全修复，p53会介导细胞凋亡。 在DNA损伤时，p53可通过其下游蛋白p21，抑制Cdk2/cyclin E活性，阻止G1/S转换。 p53还可以通过p21，抑制Cdk1/cyclin B活性，阻止G2/M转换。 细胞内的p53蛋白水平一般很低， DNA损伤后其蛋白水平显著上升。 Mdm2（murine double minute 2）是p53的一个负调控因子。 泛素-蛋白酶体系统 后期促进复合体（anaphase-promoting complex, APC）又称cyclosome，是一个具有泛素连接酶 E3活性的蛋白质复合体，调控M期的中期向后期的转化。 APC可以催化cyclin A和B的泛素化，使得它们降解，从而使Cdk1丧失活性。 APC可以催化后期抑制因子securin（在裂殖酵母中为Cut2，在芽殖酵母中为Pds1）的泛素化，使得securin降解，解除其对姐妹染色单体分离的抑制。 Cdc20为APC的正调控因子，通过与APC结合，使APC具有泛素连接酶活性，因此是姐妹染色单体分离所必需的蛋白。 5、 参与细胞周期调控的其他因素 1、测定细胞周期时间 2、细胞周期同步化 自然同步化：自然界存在的细胞周期同步过程。在动、植物及粘菌中都有所发现，它们不受人为条件的干扰，因而有可能在接近自然的条件下进行观察。 TdR双阻断法(double-thymidine block) 通过抑制DNA合成两次，将细胞同步化在G1/S交界处狭窄的时间区段。 向对数增殖期的培养细胞的培液中加入TdR，使细胞阻于S期和G1-S期交界