活化巨噬细胞培养上清液对血管平滑肌细胞增殖、胶原合成和MCP-1mRNA表达的影响-影像医学与核医学专业论文.docxVIP

活化M巾培养上清液对VSMCs增殖、胶原合成和MCP．1 活化M巾培养上清液对VSMCs增殖、胶原合成和MCP．1 mRNA表达的影响 中文摘要 活化M由培养上清液对VSMCs增殖、胶原合成 和MCP．1 mRNA表达的影响 专业名称 影像医学与核医学 学位申请人 王子亮 指导老师 杨建勇教授 中文摘要 经皮血管腔内成形术(percutaneous transluminal angioplasty，PTA)和 支架植入术(percutaneous transluminal stent ing，PTS)是治疗血管狭窄、闭 塞性疾患有效的非手术方法，技术成功率达90％以上。但术后再狭窄 (restenosis，RS)严重制约了它的中远期疗效，有研究显示，PTA术后六个月 RS发生率为20％--40％，PTS术后支架内再狭窄(In—stent restenosis，ISR) 的发生率也高达10％以上。目前RS的确切发病机制尚不明确，临床上缺乏有效 的防治手段。 内膜增生(intimal hyperplasia，IH)是血管壁对病理性刺激的一种反应，PTA 和PTS术后血管中膜的平滑肌细胞(vascular smooth musele cells，VSMCs) 变型、内迁、增殖是内膜过度增生、RS的重要原因。细胞外基质(extracellular mtraix，ECM)是新生内膜的主要结构成分，由VSMCs合成、分泌的I型和III型胶 原是其重要成分，它的堆积在一定程度上起着比VSMCs增殖更重要的作用。炎 症反应与IH密切相关，巨噬细胞(macrophage，M巾)是新生内膜中继VSMCs 的另一种主要细胞成分，也是主要的炎症细胞，它在RS形成过程中扮演着重要 的角色，但具体作用尚不明确。 在本研究中，我们利用细胞培养和分子生物等技术，检测活化M巾培养上 清液对VSMCs增殖、胶原合成和单核细胞趋化蛋白一1(monocyte chemoattractant protein一1，MCP一1)mRNA表达的影响，进一步阐明炎症细胞在内膜过度增生中 的作用、充实RS的发生机制。 活化M中培养上清液对VSMCs增殖、胶原合成和MCP—ImRNA表达的影响 活化M中培养上清液对VSMCs增殖、胶原合成和MCP—ImRNA表达的影响 中立摘曼 第一部分：细胞培养 目的：培养大鼠VSMCs，制备活化M由培养上清液。 材料和方法：健康雄性SD大鼠。取胸主动脉，分离获得动脉中膜，切成小 块用含10％FBS的DMEM培养液贴壁培养，VSMCs长到亚融合状态时胰蛋白酶 消化、传代，取3～5代细胞实验；收取大鼠腹腔内灌沈液，5％C02、37。C培养 2h,PBS强力洗涤三次，附壁的即为Mm，以lO u g／ml的LPS活化24h，洗涤 后培养24／1，离心取上清一70℃保存待用。 结果：典型的VSMCs呈梭形，具有“波峰波谷”样生长特性，Q．actin免 疫组化染色胞浆阳性着色，电镜下可见肌丝、密斑等特征性超微结构。培养的 M巾形态多变，贴壁牢固，CD68免疫组化染色胞浆和胞膜阳性着色，流式细胞 仪检测纯度达90％以上。 结论：本实验中所用的VSMCs和M m上清液都达到了设计要求。 第二部分：活化M由培养上清液对VSMCs增殖的影响 目的：观测活化M巾培养上清液对VSMCs增殖的影响。 材料和方法：本部分实验分为两大组：①依据活化Mm培养上清液终稀 释度不同分四组：I 8组(对照组)，培养液中不含活化Mm上清液；II 8组，条 件细胞培养液内活化M中上清液的终浓度为lO％；IIl8组，条件细胞培养液内活 化M巾上清液的终浓度为20％：iV4组，条件细胞培养液内活化M由上清液的终 浓度为50％，各组条件细胞培养液均孵育48h。②含20％活化M由上清液孵育 VSMCs，依据作用时间不同分为五组：I 6(对照组)，oh组；IIb，6h组；III b， 12h组；iVb， 24h组；Vb，48h组。通过显微镜下细胞计数和MTT染色 来评价细胞的增殖。 结果：在不同稀释度(0、10％、20％、50％)的活化M巾上清液作用下， 细胞计数和MTT染色结果均呈呈渐升趋势，多组之问单因素方差分析P0．05， 两两比较t检验各组之间P0．05，Spearman相关分析分别为r=0．896和r=0．856 (P0．05)。20％活化巨噬细胞上清液不同作用时间组(0h、6h、12h、24h、48h) 细胞计数和MTT染色结果相吻合，随着作用时间延长细胞密度和0D570nm吸光度 渐增，多组之间单因素方差分析P0．05，差异显著，细胞计数两两比较I b与II II 活化M七培养上清液对