流式细胞仪原理.docVIP

流式细胞仪原理 （一）流式细胞仪概念 流式细胞术（Flow Cytometry ，FCM）是一种对处在液流中的细胞或其它生物微粒（如细菌）逐个进行多参数的快速定量分析和分选的技术。 简言之，流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质，如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等进行快速测量并可分类收集的高技术，FCM以其快速、灵活、大量、灵敏和定量的特色，广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等，在各学科领域发挥着重要的作用。 （二）流式细胞仪分类 FCM仪器分为二大类。 一类为台式机，如B-D公司的FACSCalibur。其特点为：仪器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握。B-D公司的临床型流式细胞仪FACScan也是最早获得美国FDA批准可用于临床诊断的仪器。 FACSCalibur: 世界上唯一的自动化四色台式分析和分选机。提供自动进样系统、分选浓缩系统、自动免疫样本制备仪和DNA样本制备仪等选配功能。常规应用包括免疫表型分析、DNA分析、多色分析等，可广泛应用于临床和科研。 另一类为大型机，如B-D公司的FACS Vantage SE其特点为可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并且可将单个或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或板上，同时可选配多种波长和类型的激光器，适用于更广泛更灵活的科学研究应用。 FACSVantage：具有最佳分析灵活性和高速度分选功能，可通过Autosort进行自动化分选。除常规应用外，还可进行高分辨率的染色体分析。 第一部分 流式细胞仪工作原理 （一）原理 待测样本的细胞悬液，在鞘液的包围和约束下，细胞排成单列高速由流动室喷嘴喷出，形成细胞液柱。当液柱通过检测区，在入射的激光束照射下产生前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC），它们分别反映细胞大小和颗粒度，根据这些特性可以将细胞分类。经一种或几种特殊荧光标记的样本，在激光束的激发下所产生的特定荧光，可被光学系统检测并输送到计算机进行分析，得到细胞相应的各种特性。 （二）流式细胞仪检测的细胞特性 细胞结构组成 细胞功能 大小 细胞表面、胞浆、核特异性抗原 粒度 细胞活性 DNA、RNA含量 胞内细胞因子 蛋白质含量 激素结合位点 钙离子、pH值、膜电位 酶活性 第二部分 流式细胞仪构造 FCM的结构一般可分为五部分：(1)流动室及液流驱动系统; (2)激光光源及光束成形系统; (3)光学系统; (4)信号检测与存贮、显示、分析系统，(5)细胞分选系统。见图一 图一：BD公司FACSCalibur——FDA通过的世界唯一全自动四色台式分选机 注： High Performance Side-Scatter and Fluoresence Photomultiplier:高性能侧向角散射光及荧光光电倍增管 Argon Laser:氩离子激光 Beam-Shaping Optics:光束成形镜 Red Diode Laser:红色二极管激光 Low-Angle, Light-Scatter Detector:前向角散射光检测器 （彩图） (一)、流动室与液流驱动系统 流动室(Flow Chamber或 Flow Cell)是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央开一个孔径为430×180um的长方形孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，这种流动室的光学特性良好，流速较慢,因而细胞受照时间长，可收集的细胞信号光通量大，配上广角收集透镜，可获得很高的检测灵敏度和测量精度。 流动室内充满了鞘液,鞘液的作用是将样品流环包。鞘液流是一种稳定流动，操作人员无法随意改变其流动的速度,样品流在鞘流的环包下形成流体动力学聚焦，使样品流不会脱离液流的轴线方向，并且保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。 细胞流和鞘液流的驱动一般采用加正压的方法，流速与压力的关系服从 Bernoulli方程，即P = (?) pv2 (忽略高度的变化)，可见只要压力恒定，就可得到恒定的鞘液流流速, 从而可确保每个细胞流经激光照射区的速度不变。 图二：FACSCalibur液流系统 低速(Low) 高速(Hi) 图三：流动池中，不同流速下的细胞流动情况 从图二可以知道,真空泵产生压缩空气,通过鞘流压力调节器加在鞘液上一恒定的压力(压力的大小由工厂设定),这样鞘液以匀速运动流过流动室,在整