2012级生物化学与分子生物学实验设计-2.pptVIP

年级：2012级 专业：麻醉学 实验课时间：第17周周一（2013年6月17日） 实验室：第三实验室 组别：第二实验组 组员：曹 毅（201206008 ） 徐 敏（201206009） 宁丽娟（201206010） 牛 钦（201206011） 潘雪婷（201206012） 薛 娟（201206013） 肖 璘（201206014） 张红娇（201206015） 报告人：;2012级 生物化学与分子生物学实验设计;案例 ： 患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。 体格检查：体温38℃，脉搏150次/分，呼吸40次/分，血压80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异常。实验室检查：红细胞 1.98×1012/L，血红蛋白53g/L，血清总胆红素85.5μmol/L，结合胆红素13.7μmol/L，未结合胆红素71.8μmol/L，尿蛋白（++），潜血(+)，尿胆红素(－)，尿胆素原(+)，尿液镜下未见红细胞。 ;1. 根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患儿是何种疾病？（必答） 2. 请设计实验进一步明确诊断。（必答）要求：实验名称，实验方法，主要试剂和仪器，实验操作流程及注意事项，结果如何分析。 3. 从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果。（必答） 4. 要想探讨该病发生的分子基础，可以用哪些技术检测什么目的基因？（选答） 5. 患者体型瘦小与该病症是否有关，为什么？（选答） ;1. 根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患儿是何种疾病？ ;根据患儿的临床表现和体格检查，可初步判断该患儿患的是 G6PD（葡萄糖6—磷酸脱氢酶）缺乏症 俗称蚕豆病;恶心、呕吐、面色苍白 ; G6PD缺乏症的临床类型;G6PD缺乏症的临床表现;蚕豆病的发病原因;蚕豆病的发病表现;2.请设计实验进一步明确诊断  （要求：实验名称，实验方法，主要试剂和仪器，实验操作流程及注意事项，结果如何分析。);高铁血红蛋白还原试验 G6PD荧光斑点试验 红细胞G6PD活性测定;一、高铁血红蛋白还原试验;【主要试剂】 0.18mol/L亚硝酸钠-葡萄糖溶液①、 0.4mmol/L亚甲蓝溶液 ②、0. 28 mol/ L 葡萄糖溶液③、混合液 （等量①+②+③）、生理盐水、抗凝剂;【实验流程】;【实验流程】;计算高铁血红蛋白还原率 公式：MHb % = (1 - A/ S) ×100 % ;二、G6PD荧光斑点试验 ;【主要试剂】反应液：G-6-P液1份、NADP液1份、皂素2份、磷酸盐缓冲液3份和蒸馏水3份混匀;;;【主要试剂】生理盐水、溶血素 、3.8mmol/L NADP 、0.5mol/L Tris缓冲液（pH7.5） 、0.63mol/L氯化镁溶液 、33mmol/L G-6-P液 ;取抗凝血2ml，生理盐水洗涤红细胞3次（1500r/min离心 10min）; G-6-PD活性测定的操作表（Zinkham法 );计算公式：G-6-PD活性（U/gHb） =△A/min×1000/6.22×1020/20× Hb(gL-1) ;注意事项;结果分析方法;二、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶荧光斑点试验 正常人： 0min斑点无荧光，5-10min出现， 10min荧光最强 临床诊断： 轻度缺陷者：0-10min荧光很弱或不出现 中度缺陷者：10-30min出现荧光 严重缺陷者：30min内不出现荧光;三、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性测定 G6PD缺陷者：G6PD活性较正常平均值低40%以 上即可作出诊断;必答题一：从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果。;（1）急性贫血、溶血：因G6PD基因的缺陷不能提供足够的NADPH以维持还原型谷胱甘肽（GSH）的还原性（抗氧化作用），在遇到蚕豆中某种因子后更诱发了红细胞膜被氧化，红细胞膜上的磷脂分子中的不饱和脂肪酸氧化生成过氧化脂质，损害细胞膜。G6PD有保护正常红细胞免遭氧化破坏的作用，新鲜蚕豆是很强的氧化剂，当G6PD缺乏时则红细胞被破坏而致病。 ;（2）溶血性黄疸：红细胞本身的内在缺陷或红细胞受外源性