研究生专题讲座(08).ppt

组织化学技术 histochemistic technology 细胞组织化学技术 cyto-histochemistic technology 原位检测技术 in situ detector technology （三）免疫荧光染色方法 1、直接法：用已知特异性抗体与荧光素结合，制成特异 性荧光抗体，直接用于细胞和组织抗原的检查。 优点：特异性高 缺点：一种荧光 抗体只能 检测一种 抗原。 2、间接法：用特异性的抗体（1抗）与细胞或组织标本反应，随后用缓冲液洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧光抗体（2抗）与结合再抗原上的抗体结合，形成抗原 → 抗体 → 荧光抗体的复合物。 优点：荧光亮度增强， 提高了敏感度 （四）非特异性染色的消除方法 1、非特异性染色的主要因素 1）部分荧光素未与蛋白质结合，形成聚合物和衍化物而不能被透析除去。 2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分非特异结合。 3）组织内类属抗原的存在。 4）从组织中难以提纯抗原性物质。 5）抗体分子上标记的荧光素太多。 6）荧光素不纯，标本固定不当。 7）细胞和组织内某些物质自发荧光。 8）染色时间过长，温度过高，冲洗不够或标本干燥。 2、消除的方法 1）衬染法（可抑制自发荧光） 2）胰蛋白酶消化（可抑制非特异性荧光） 3）吸收（用小属肝粉消除组织非特异性荧光的染色） 4）用正常（非免疫）血清（清除自发荧光和非特异性荧光） 5）提高抗体和荧光抗体的质量 （五）荧光显微镜及检测方法 略 （六）染色标本的保存 原则上应立即再荧光显微镜下观察，拍照，此时荧光最强。 用缓冲甘油封片，保存在4℃中，过夜后特异性荧光强度减弱25％，保存1周后减弱60％。 Nikon 荧光显微镜 肾活检（直接法） 肾活检（直接法） 肾活检（直接法） 低倍视野 肾活检（直接法） 肾活检（直接法） 第五部分：免疫电镜技术 概述 免疫电镜技术(immunoelection microscopy,IEM)是利用抗原和抗体特异性结合的原理，在超微结构水平定位、定性及半定量显示抗原的技术方法。 从细胞超微结构水平研究和观察抗原抗体的免疫反应，必须使抗体带上具有高电子密度的标记物，这样才能在电镜下观察反应分结果。 到目前为止，已有三种标记技术： 铁蛋白标记技术；酶标记技术；胶体金标记技术 （一）免疫电镜的基本技术方法 1、标本的处理 1）取材 各种培养细胞和分离的血细胞应随用随取； 游离的培养细胞可先进行离心； 贴壁细胞可在载玻片上固定，也可用胰蛋白酶将细胞消化下来； 取组织块时应做到越快越好，最好在没有停止血流前取材 。 2）固定 固定液的选择：既要保存细胞的超微结构，又要尽可能的 保存抗原的活性 A 多聚甲醛加低浓度的戊二醛固定液（PG固定液） B 过碘酸盐－赖氨酸－多聚甲醛混合固定液（ PLP固定液） C 苦味酸－多聚甲醛－戊二醛固定液（PAPG固定液) 固定方法与时间： A 血管灌注固定（最好方法） B 浸泡固定 C 微波固定 2、基本技术方法 1）包埋前免疫电镜技术 是指先对标本进行免疫标记，然后进行包埋、切片、观察。 2）包埋后免疫电镜技术 是指组织标本经固定及树脂包埋，制作成超薄切片后再进行免疫化学染色方法。 包埋前与包埋后的比较 未经锇酸固定、脱水、树脂包埋及高温聚合的过程，标记的阳性率高，提高电镜的检出率。 免疫染色完毕后用戊二醛与锇酸作后固定，可使抗原抗体结合的更加牢固，并有利于膜结构的保存。 标记前细胞内抗原受到标记抗体的穿透性限制（因是组织块） 制作厚切片；增加细胞膜的通透性 包埋前 具有阳性结果重复性高、方法简便可靠的优点，可对同一组织块的连续切片作各种对照染色，能十分准确的解释染色结果，而且还能在同一张切片上进行多重免疫染色。 抗原在脱水、浸透及树脂包埋过程中可能被破坏，使免疫染色的阳性率下降。 细胞膜保存差（锇酸作用） 固定液选择苦味酸(保护细胞膜) 包埋剂协作低温树脂 包埋后 优点 缺点 修正 IgAN, TGF?2的表达，免疫金银法 K4M低温包埋剂和紫外线低温包埋机联合的免疫电镜法 （实验结果介绍） 免疫电镜技术是从超微结构水平能显示抗原和抗体结合后在细胞微细结构水平的定位，这一技术已成为目前生物医学领域的一项重要研究手段。但是，由于免疫电镜技术因多种原因造成的重复性差或技术的不稳定性，加之