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下一代测序技术 摘要：DNA测序技术对生物学的发展有着最根本的意义。Sanger法测序经过了30年的应用和发展，而在过去三年中，以454, solexa, SOLiD为代表的高通量测序平台已经大幅度降低了测序成本，提高了测序速度，成为基因组测序市场的主流。在此基础上，各种下一代测序技术正在快速研发，将使基因组测序和重测序的通量和成本更加平民化，为基因组学、遗传学、生物医学和健康科学等领域的发展创造更加广阔的前景。本文将对所有新的测序技术的原理、优势和应用进行总结和展望。 1977年Maxim、Gilbert发明的化学降解法测序技术和Sanger发明的双脱氧末端终止法测序技术不仅为他们赢得了诺贝尔奖，也使得从DNA序列层面研究分子遗传学成为可能。特别是后者，从最开始的凝胶电泳到越来越高通量的毛细管电泳，从开始的手工操作到越来越多自动测序仪的出现，各种改进的Sanger测序技术统治了DNA测序领域三十年，至今仍在长片段测序，大片段文库测序方面有广泛的应用。人类基因组计划（HGP）的完成就是靠Sanger测序法。 在耗费了庞大成本的人类基因组计划宣布完成之后，越来越多的物种基因组测序工作对测序成本和通量提出了更高的要求，新一代测序技术（也被称为第二代测序技术）开始登上历史舞台。2005年454 life science公司率先推出了焦磷酸测序技术，使测序成本较Sanger法降低了100倍，速度快了（提高）100倍，人类基因组测序逐步进入了100，000美元时代。如今，454 FLX测序仪（Roche Applied Science）、基于“边合成边测序”的Solexa测序仪(Illumina Inc.)和使用“边连接边测序”的SOLiD测序仪(Applied Biosystems)已经成为基因组测序市场的主流机型。除此之外，2008年一年内又有HeliScope单分子测序仪（Helicos）和Polonator(Dover/Harvard)两种测序机型商品化。 在NHGRI（美国人类基因组研究中心）的支持和推动下，未来几年内测序成本将在目前基础上再下降100倍，最终使个人基因组测序成本降至1000美元，人类将革命性的进入个人基因组时代。高通量和低成本的测序技术将进入到普通实验室，基因组测序的简单化将使分子生物学飞跃发展，个人基因组测序产业化也将对健康医学等领域产生革命性的影响。本文将首先对目前已经商品化的新一代测序技术（454、Solexa、SOLiD、HeliScope）做一介绍和比较，再对正在研发中的各种下一代测序方法（第三代测序技术）的原理和应用做一详细的介绍和展望。 1. Roche 454测序技术 2005年454生命科学公司在《自然》杂志发表论文，介绍了一种区别于传统Sanger法的全新高通量测序方法，将测序成本降低了100倍以上，开创了第二代测序技术的先河，454测序仪也成为最先商品化的第二代测序仪。正是在此基础上，其它如Solexa、SOLiD等第二代测序仪才相继问世。454测序技术的原理在于首先使用乳液PCR（emulsion PCR）技术（图一a）扩增已经连接上接头的基因组文库片段，扩增子结合在28 μm的磁珠表面，将乳液破坏后用变性剂处理磁珠，再将含有扩增子的磁珠富集到芯片表面，用测序引物进行测序。在测序过程中，454使用了一种“焦磷酸测序技术”（Pyrosequencing），即在合成DNA互补链的过程中，每加入一种单核苷酸（dNTP），如与模板链配对结合，就会释放出一个焦磷酸，与底物腺苷-5’-磷酸硫酸（APS）在ATP硫酸化酶作用下合成ATP，与荧光素（Luciferin）一起在荧光素酶(Luciferase)的作用下，会发出一个光信号，由芯片背后连接的电荷耦合装置（CCD，Charge Coupled Device）捕捉。 454测序技术合成DNA链使用的是普通单核苷酸，没有任何标记，合成中也没有切割基团等生化反应，因此读长可以达到300-400bp。但没有阻断（block）和去阻断（de-block）过程也意味着对连续重复单核苷酸的阅读只能根据信号强度来判断，容易对其中插入和缺失碱基阅读错误。454测序技术相比较其他第二代测序技术如Solexa和SOLiD, 在读长上有着巨大的优势，但是目前成本要略高。总体而言，高读长使得454技术比较利于De Novo拼接和测序。 焦磷酸测序原理（Pyrosequencing） 2. Illumina Solexa测序技术 2006年包括Illumina和Solexa在内的四家公司合作开发出了一种基于“边合成边测序”（Sequence By Synthesis）原理的新测序技术。这种测序仪后来被成为Illumina