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中华人民共和国专业标准 蛋 白 酶 活 力 测 定 法 SB/T 10317-1999 Measurement of proteinase activity ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。 1 福林法 1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯 1.1.1 福林试剂(Folin 试剂):于2000mL 磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4 ·2H2O) 100g,钼酸钠(Na2MoO4 ·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流 10h。 取去冷凝器,加入硫酸锂(Li2SO4)50g,蒸馏水50mL,混匀,加入几滴液体溴,再煮沸15min, 以驱逐残溴及除去颜色,溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色,需要再加几滴溴液,再 煮沸除去之。冷却后,定容至1000mL,用细菌漏斗(No4～5)过滤,置于棕色瓶中保存。此溶 液使用时加2 倍蒸馏水稀释。即成已稀释的福林试剂。 1.1.2 0.4mol 碳酸钠溶液: 称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g,定容至1000mL。 1.1.3 0.4mol 三氯乙酸(T C A)溶液: 称取三氯乙酸(CCL3COOH)65.4g,定容至1000mL。 1.1.4 pH7.2 磷酸盐缓冲液:称取磷酸二氢钠(NaH2PO4 ·2H2O)31.2g,定容至1000mL,即 成0.2mol 溶液(A 液) 。称取磷酸氢二钠(Na2HPO4 ·12H2O)71.63g,定容至1000mL,即成 0.2mol 溶液(B 液) 。 取A 液28mL 和B 液72mL,再用蒸馏水稀释1 倍,即成0.1mol pH7.2 的磷酸盐缓冲液。 1.1.5 2%酪蛋白溶液:准确称取干酪素2g,称准至0.002g,加入0.1N 氢氧化钠10mL,在 水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸),然后用pH7.2 磷酸盐缓冲液定容至100mL 即 成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存,否则极易繁殖细菌,引起变质。 1.1.6 100 μg/mL 酪氨酸溶液:精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g,逐 步加入6mL 1N 盐酸使溶解,用0.2N 盐酸定容至100mL,其浓度为 1000 μg/mL,再吸取此液 10 mL, 以0.2N 盐酸定容至 100mL,即配成100 μg/mL 的酪氨酸溶液。此溶液配成后也应及时 使 用或放入冰箱内保存, 以免繁殖细菌而变质。 1.2 仪器 a. 分析天平: 感量0.1mg; b. 581-G 型光电比色计或72 型分光光度计; c. 水浴锅; d. 1 、2、5、10mL 移液管等。 1.3 操作 1.3.1 标准曲线的绘制 按下表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液(表1)。 表 1 配制各种不同浓度的酪氨酸溶液 ━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ┃ 管 号 试 剂 ┣━━┳━━┳━━┳━━┳━━┳━━━ ┃ 1 ┃ 2 ┃ 3 ┃ 4 ┃ 5 ┃ 6 ━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━ 蒸馏水,mL ┃10 ┃ 8 ┃ 6 ┃ 4 ┃ 2 ┃ 0 100 μg/mL 酪氨酸,mL ┃ 0 ┃ 2 ┃ 4 ┃ 6 ┃ 8 ┃ 10 酪氨酸最终浓度, μg/ml ┃ 0 ┃ 20 ┃ 40 ┃ 60 ┃ 80 ┃ 100 ━━━━━━━━━━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━━ 测定步骤:取6 支试管编号按表1 分别吸取不同浓度酪氨酸1mL,各加入0.4mol 碳酸钠 5mL,再各加入已稀释的福林试剂 1mL。摇匀置于水浴锅中。40℃保温发色 20min 在 581-G 型光电比色