丙型肝炎病毒核酸扩增检测标准操作规程.doc

医院检验科 临床基因扩增检验实验室 丙型肝炎病毒核酸扩增荧光定量检测标准操作程序 编号：SOP―××× 第 PAGE 6 页 共 NUMPAGES 6 页 编写人 审核人 批准人 生效日期 丙型肝炎病毒(HCV)核酸扩增(PCR) 荧光定量检测标准操作程序 一、目的：明确丙肝病毒核酸定量检测的操作规程，指导检验人员正确进行丙肝病毒核酸定量的检测,保证检测结果及时可靠。 二、范围：适用于进行丙肝病毒核酸定量检测的检验人员。 三、职责：实验操作人员应严格按操作规程进行实验。 四、检测原理：本试剂盒从血清或血浆中提取HCV RNA，在逆转录酶作用下将RNA逆转录为HCV cDNA，在引物的指导下，以四种脱氧核苷酸为底物，通过耐热DNA聚合酶的酶促作用，对cDNA进行体外扩增，用Taqman探针法检测扩增产物。通过标准曲线，即可计算出被检物的含量。 五、试剂： 1. 来源：上海科华生物工程股份有限公司HCV核酸扩增荧光定量检测试剂盒〔国药准字。 2. 规格：32人份/盒。 3. 试剂盒组成： 3.1 病毒RNA提取试剂：用于从血清或血浆中提取HCV RNA。 裂解液 4ml×1瓶 含有硫氰酸胍的溶液 助沉剂 1瓶 含有助沉剂的冻干粉末 去抑制剂 1瓶 含有去抑制剂的冻干粉末 洗涤液A 14ml×1瓶 含有硫氰酸胍的溶液 洗涤液B 4ml×1瓶 含有Tris的溶液 洗脱液 1.8ml×2支 含0.04% NaN3的灭菌双蒸水（无RNase） 核酸提取柱 32支×1包 含连接套管 3.2 核酸扩增（PCR）― 荧光检测试剂： RT―PCR试剂 PCR主反应液 250ul×1支 含有一对引物和dNTP的溶液 酶混合物 180ul×1支 含有Taq酶、逆转录酶和RNA酶抑制剂的溶液 荧光探针 20ul×1支 含有荧光探针的溶液 对照品 阴性对照 250ul×1支 含有0.05% NaN3的HCV RNA阴性的混和人血清 强阳性对照 250ul×1支 含有约2×106 IU/ml的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA 弱阳性对照 250ul×1支 含有约2×104 IU/ml的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA 工作标准品① 250ul×1支 含有适量的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA 工作标准品② 250ul×1支 含有适量的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA 工作标准品③ 250ul×1支 含有适量的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA 工作标准品④ 250ul×1支 含有适量的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA 工作标准品①～④的参数和强、弱阳性对照的定值允许范围根据批号不同而不同。详见试剂盒的说明书附页。 六、仪器：Roche LightCycler 七、操作程序 1、样本处理（标本处理区进行） 标本处理（所有操作需采用无RNA酶的带滤芯吸嘴及离心管，在标本处理区进行） 1.1试验前准备 1.1.1将裂解液置70℃加热5分钟，使试剂瓶内的结晶全部溶解。吸取1ml裂解液加到助沉剂的试剂瓶中，用吸嘴搅动，混匀后全部吸回到裂解液瓶中，混匀后备用。 1.1.2 在去抑制剂的试剂瓶中加入700ul洗脱液，用吸嘴搅动，溶解后混匀备用。 1.1.3 在洗涤液A的瓶子中加入6ml无水乙醇，颠倒混匀后备用。 1.1.4 在洗涤液B的瓶子中加入16ml无水乙醇，颠倒混匀后备用。 1.2 病毒RNA提取 1.2.1取n个0.5ml离心管（n＝标本数量+阴性对照、强阳性对照、弱阳性对照和4个工作标准品），做好标记后分别加入100ul已混有助沉剂的裂解液。 1.2.2分别用带滤芯吸嘴加入100 ul需处理的血清或血浆标本和对照品，用带滤芯吸嘴反复吹打5次。 1.2.3 再分别用带滤芯吸嘴加入20 ul 去抑制剂，盖上管盖，振荡混匀，离心数秒，置70℃反应10分钟。 1.2.4 离心数