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dna的定量测定实验报告 　　生物学大实验　　实验名称：质粒扩增、提取和鉴定实验实验目的通过对智力扩增、提取和鉴定试验的实验原理介绍和实际操作，加深对分子生　　物学基本技术的理解和掌握。实验仪器设备：电子天平、高压蒸汽灭菌锅、摇床、离心机、不同型号移液枪若干支、　　磁力搅拌器、恒温水浴锅、电炉、制冰机、琼脂糖凝胶电泳仪、超净工作台等。实验原理：质粒主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中，通过对细菌、放线菌和真菌的　　培养来实现对质粒的扩增。经过处理的线状dna在外界环境恢复正常的时候不能够复性而质　　粒dna可以复性，从而可以实现质粒dna和染色体dna的分离。限制性内切酶能特意地结合　　于一端被称为限制性酶识别系列的dna系列之内或其附近的特异位点上，并切割dna。当对　　提取的质粒dna进行电泳时，同一质粒dna其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的　　泳动速度快。　　实验步骤：　　一质粒扩增　　普通lb固体培养基制备：制备lb培养基，倒入灭菌瓶中高压灭菌，待完全冷却后，保存备用。　　将大肠杆菌接种于lb培养基中，37℃振荡培养过夜(200转/分)　　二质粒dna的提取(碱法)1将菌液倒入的微量离心管中，1XXrpm离心一分30秒，弃去上清液，以得到　　较多的细菌沉淀；　　2、将微量离心管开口倒置在卫生纸上，使离心管底部的液体流尽。　　3、加入100μl用冰预冷的溶液i，剧烈振荡，将沉淀彻底悬浮，然后室温放置5分钟。　　4、加入200μl现配的溶液ii，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管，使混合物混匀，冰浴5～10分钟。　　5、加入150μl预冷的溶液iii，盖紧管口，温和颠倒混匀，使粘稠地细菌裂解物均匀　　地分布于溶液iii中，冰浴5分钟。　　6、取上部水相，移入新的离心管，加入2倍体积预冷的无水乙醇，震荡混匀，室温放置10分钟沉淀双链dna，然后4℃，1XXrpm离心10min。　　7、弃去上清液，将离心管倒置于卫生纸上，使离心管底部的液体流尽后，加入预冷的　　1ml70％乙醇。　　8、弃去上清液，将离心管倒置于卫生纸上，使液体流尽，置dna干燥5～10分钟。　　9、吸除上清液，将管口倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。10、将沉淀溶于34υlte缓冲液或灭菌水中，储于-20℃冰箱中三dna酶切反应　　1、将洁净干燥并经灭菌的eppendorf管编号，用微量移液枪分别加入　　dna和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2υl，将管内溶液混匀后加入υl酶　　液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可以用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。此步操　　作是整个实验成败的关键，要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱　　的时间，以免活性降低。　　2、混匀反应体系后，将eppendorf管置于适当的支持物上，　　37℃水浴锅保温2-3小时，使酶切反应完全。　　3、每管加入2υ/ledta，混匀，以停止反应，置于冰箱之保存备用。　　四dna的琼脂糖凝胶电泳　　1、取5×tbe缓冲液100ml加蒸馏水至1000ml，配成×tbe稀释缓冲液，待用。　　2、胶液的制备：称取3g琼脂糖置于1000ml锥形瓶中，加入300ml×tbe稀释缓　　冲液，加入微波炉里加热至琼脂糖全部融化，取出摇匀，此为1%琼脂糖凝胶液。加热过程中　　要不时摇动，使其附于瓶盖上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜，以减少水分蒸　　发。　　3、胶版的制备：想冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭溶液使其终浓　　度为υlg/ml。倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则溶液出　　现气泡，待胶完全凝固后，拔出梳子注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入υ×　　tbe稀释缓冲液至页面恰好没过胶板上表面　　4、加样：取20υl的酶解液与2υl10×载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽　　中，每加完一个样品要更换tip头以防止互相污染，注意上样时要小心操做，避免损坏凝胶　　或将样品槽底部的凝胶刺穿　　5、电泳：加完样后合上电泳槽盖，立即接通电源，控制电压保持在60-80v，电流在　　40ma以上，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿2cm时停止电泳　　6、观察和拍照　　五实验结果　　六实验结论　　通过本次试验加深了对分子生物学以及基因工程的深入了解，右上第三第四根亮柱是我　　的结果。结果显示，第三条中酶切效果良好，rna被降解的很完全，第四根没有被酶切，质　　粒dna跟rna同时存在，出现了两条亮带，质粒dna跟rna分离效果较好。本实验需要细致认真的完成，所以特别在凝胶电泳中要十分注意以下事项：　　取出梳子之前，一定要耐心等