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promega双萤光素酶报告基因实验 　　双荧光报告基因检测系统简明操作步骤　　试剂准备：　　磷酸盐缓冲液(PBS)　　PBS缓冲液，10X(每升)　　Na2HPO4　　2gKH2PO4　　80gNaCl　　2gKCl　　溶于1升无菌去离子水中。1XPBS的pH应为　　1.制备被动裂解缓冲液1×PLB：将1倍体积的5×PassiveLysisBuffer(PLB)加到4倍体积的蒸馏水中。混合均匀。储存在4℃。建议每次使用前配制新鲜的1XPLB。5XPLB应储存在-20℃。　　2．LARⅡ：用LuciferaseAssayBufferⅡ溶解冻干粉LuciferaseAssaySubstrate。存于-20℃或-70℃。　　3．StopGlo试剂：　　a.取50×StopGlo?Substrate加到105ml的StopGlo?Buffer。在提供的棕色StopGlo?Reagent瓶中，振摇10秒。在-20℃存15天。　　b.若配制少量的1×StopGlo?Reagent：将一定量的50×StopGlo?Substrate加入到所需要量的StopGlo?Buffer中，使终浓度成为1倍浓度。　　细胞裂解　　1．除去培养细胞中的培养基。　　2．用1×PBS清洗培养细胞。去掉清洗液。　　3．按推荐体积将1×PLB加入到培养孔中。　　第3步中使用的1×PLB体积　　被动裂解主动裂解　　培养板1×PLB平板大小1×PLB　　6孔500ul100×200mm1ml　　12孔250ul60×15mm400ul　　24孔100ul35×12mm200ul　　48孔65ul6孔250ul　　96孔20ul12孔100ul　　4．被动裂解：在室温轻缓晃动培养板15分钟，把裂解液　　转移到检测试管中。　　结果检测　　a.检测96孔板中的样品：　　开始之前：　　设置自动进样器1和2分别分装100ul的LARII和StopGlo?试剂。　　测量时，使用1-2秒延迟和5-10秒读数。之内）　　1、加入≤20ulPLB裂解液/孔　　2、加入100ulLARII　　3、检测萤火虫萤光素酶　　4、加入100ulStopGlo?试剂　　5、检测海肾萤光素酶的活性　　6、其它孔如此循环操作。　　b.用手动或配有单自动进样器的萤光发光仪进行检测：　　1、事先在检测管中加入100ulLARII　　2、转移20ulPLB裂解液到检测管中，混合。　　3、检测萤火虫萤光素酶的活性　　4、向检测管中加入100ulStopGlo?Reagent　　5、检测海肾萤光素酶活性　　双荧光素酶报告基因质粒构建　　基因3’UTR的克隆，　　表Slug基因3’UTR基因克隆及结合区突变引物：引物名称　　Slug-3’UTR-PF　　Slug-3’UTR-PR　　Slug-mut-PF　　Slug-mut-PR：引物序列5-TCGACCGGTTGAGTGACGCAATCAATGTTTACTCGAAC5--GGACTAGTCAAACAATTCTTTGTACAGTGGTTTGGTAC5-GATTAGTCCTGAACATCCATGGCGCATGCTCCATTGTCTTAC5-ATGGATGTTCAGGACTAATCTTTCCCTCCTCCCCCAAGGCAC上游酶切位点为AgeI，下游为平末端。　　载体信息　　HinNotHinSacHinSacBglHinI(1711)　　I(1717)　　II(1749)　　II(1815)　　II(1856)　　I(1874)　　dIII(1914)　　I(2291)　　启动子活性分析　　一、　　二、实验目的：分析启动子活性实验原理：荧光素酶报告基因的活性用Dual-Luciferase?ReporterAssay　　System试剂盒来检测。利用单通道多标记荧光检测仪测定荧光素酶活性。在双荧光素酶系统中，除了用于检测启动子活性的萤火虫荧光素酶外，另外一种组成型表达的Renilla荧光素酶质粒PRL-TK也被同时转染入细胞内作为内参。　　三、实验材料：Dual-Luciferase?ReporterAssaySystem试剂盒，　　PBS，细胞裂解液，96孔，　　四、　　五、实验设备：单通道多标记荧光检测仪实验方法及步骤：　　1）启动子萤光素酶报告载体与共转染质粒按照质量等比例、总量μg的　　原则转染细胞，36h后收获细胞；　　2）96孔板吸弃细胞培养基，PBS冲洗细胞一次，加入1×PLB细胞裂解液　　20μl，置于室温震荡裂解20min；　　3）轻轻吹打细胞，取10μl细胞裂解液加入50μlLucifera