实验室检测在疫病防控中的作用和实验室的质量管理体系.pptVIP

质量管理体系 实验室质量管理体系的管理要素 改进 不符合工作控制 纠正措施 预防措施 记录的控制 管理评审 内部审核 组织 管理体系 文件控制 要求、标书和合同评审 分包 服务和供应 服务客户 抱怨 实验室质量管理体系的技术要素 人员 设施和环境条件 检测和校准方法 设备 测量溯源性 抽样 样品的处置 结果的质量保证 结果报告 实验室检测的质量控制 内部质量控制 人员、环境设施、试剂、仪器、检测方法是质量控制的基础。 方法：标准物质或已知的对照；使用人员比对、方法比对、仪器比对等进行复现性检测； 外部质量控制 实验室间比对实验 能力验证计划； 实验室样品的管理 样品接收、标识、制备、流转、储存、保管和处置 唯一性标识 样品流转的监控 样品的制备：组织样品的制备；棉拭子样品的制备；全血样品的制备 建立质量保证之路 实验室的机构设置、责任和权力委派 领导能力、激励和监督 创立有活力的团队 给出时间表和阶段性任务指标 质量手册、程序、作业指导书和表格的文件化 测试方法的选择、制定和批准生效 设备的选择、管理和校准 设施和环境的控制 消耗品和参考标准的控制 内部和外部质量控制 样品的接受、标识、处理和存储 审核和管理评审以及随后的改进 请求和获得认可 欢迎提问！谢谢大家！ 实验室检测在疫病防控中的作用和实验室的质量管理体系 马清霞 2013.1.11 内容 实验室常用的检测方法 病原学（细菌、病毒分离；PCR、ELISA、病理切片）， 血清学（血凝及血凝抑制、ELISA） 实验室的质量控制 国内的认证认可：CNAS和CAM 实验室内部的质量管理体系 实验室检测目的 快速诊断疫病 免疫效果评价 疫情监测 禽流感、新城疫的检测 1、发病动物：荧光定量RT-PCR；HA/HI（非免疫禽），胶体金试纸条 2、免疫效果评价及抗体监测： HA/HI ， 3、样品：棉拭子样品：禽类的咽喉、泄殖腔棉拭 子，浸润在PBS抗生素缓冲液中。处理方法：充 分挤压棉拭子，5000转/分钟离心，取上清；可以每5份混养检测。 组织病料：取肺脏，气管、脑、肾脏等 4、检测方法：荧光定量试剂盒 5、检测方案：先做AI通用，再进行H5、H9分型 AI和ND 口蹄疫检测 1、发病动物：荧光定量RT-PCR，普通RT-PCR； 2、活体动物调运前：非结构蛋白ELISA 3、免疫效果评价或抗体监测：液相阻断ELISA（AsiaI型、A型、O型），正向间接血凝（O型） 正向血凝与液相阻断ELISA的比较 正向血凝：成本低，快捷，重复性差，受人为因素影响大 液相阻断ELISA：成本高，步骤繁琐，但可以定量检测FMD的抗体滴度。 FMD的荧光定量RT-PCR检测 猪瘟检测 1、目前检测CSFV的方法：免疫荧光试验、血清中和试验、ELISA、病毒分离、动物接种试验、RT-PCR法等 2、发病动物：RT-PCR或猪瘟抗原ELISA （全血或扁桃体等组织病料） 3、猪瘟净化或活体调运：猪瘟抗原ELISA或RT-PCR；猪瘟荧光抗体检测。(活猪取扁桃体） 4、免疫效果或抗体监测：猪瘟正向间接血凝 猪瘟荧光定量RT-PCR 抗原ELSA与RT-PCR 均能检测病原，ELISA通过免疫学的抗原抗体结合的原理，检测病毒或细菌的抗原表位。PCR通过分子生物学检测病原的核酸。 均具有高敏感性，高特异性 ELISA实验中的注意事项 1、样品的要求：血清：澄清、减少溶血、减少细菌污染；避免反复冻融。其他液体样品：新鲜、澄清、无污染。 2、充分洗涤 3、不同试剂盒的底物、终止液不能混用：OPD一般用硫酸做终止液；TMB的终止液比较多，颜色变化也不 一样。 猪蓝耳病的检测 发病动物：病毒分离，间接免疫荧光抗体染色；荧光RT-PCR或普通RT-PCR 免疫效果评价：蓝耳病ELISA PRRSV荧光定量RT-PCR 阴性对照 阳性对照 普通PCR PCR：敏感性高，特异性高，检测周期短 普通PCR：假阳性率高，不能正确指导临床实践。因此国家卫生部曾在1997年行文禁止将普通PCR技术用于临床诊断。 荧光定量PCR方法 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 荧光定量PCR的种类 非特异性荧光标记： 1、 SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan 3、Molecular Beacon 两种荧光定量PCR的特点—SYBR Green 法 优点 对DNA模板没有选择性 适用于任何DNA 使用方便 不必设计复杂探针 非常灵敏