课件：离心分离第讲.ppt

蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域 概述 沉淀法操步骤 ： 沉淀剂 粒子生长 收集沉淀物 过滤 离心 概述 沉淀法 （1）盐析法； （2）等电点沉淀法； （3）有机溶剂沉淀法； （4）非离子型聚合物沉淀法； （5）聚电解质沉淀法； （6）高价金属离子沉淀法等。 除第（3）种有机溶剂沉淀法也能适用于抗生素等小分子外，其他各种方法只适用蛋白质等大分子。 分类 蛋白质盐析 因此，可通过降低蛋白质周围的水化层和双电层厚度（ζ电位）降低蛋白质溶液的稳定性，实现蛋白质的沉淀。 蛋白质稳定因素 水化层 双电层 使蛋白质形成稳定的胶体溶液 静电排斥作用 蛋白质盐析 中性盐 蛋白质脱水 中和电荷 沉淀 盐析法机理 （1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集， 将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。 （2）破坏水化膜，暴露出憎水区域，由于憎水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越易沉淀。 （3）中和电荷，减少静电斥力， 中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。 蛋白质盐析 THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 盐析用盐的选择 盐析作用要强 盐析用盐需有较大的溶解度 盐析用盐必须是惰性的 来源丰富、经济 盐析操作 蛋白质盐析 ①直接加入固体(NH4)2SO4 粉末，工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高； ②是加入硫酸铵饱和溶液，在实验室和小规模生产中，或(NH4)2SO4 浓度不需太高时，可采用这种方式，它可防止溶液局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。 蛋白质盐析 阴离子： 柠檬酸＞PO43- ＞SO42- ＞ CH3COO-＞ Cl-＞ NO3- 阳离子： NH4+ ＞ K+＞Na+ ＞高价阳离子 硫酸铵： （1） 价廉 ；（2） 溶解度大，稳定蛋白质 ；（3）水解变酸；（4）高pH 释氨，腐蚀；（5）残留产品有影响。 盐析效果 影响因素 蛋白质盐析 pH 变化 温度变化 等电点附近有极小值 随温度升高减小，热促失水膜 lgS 蛋白质盐析 盐析注意事项： (1) 稳定pH 用磷酸缓冲液 （2）硫酸铵加入后体积变大 （3）选择饱和度 （4）分步盐析 （5）初始蛋白浓度 ㏒ S=β-ＫsＩ S—蛋白质的溶解度，g/L; I－离子强度， I=1/2∑mizi2 mi—离子 i的摩尔浓度； Zi—所带电荷 β—常数，图中截距 Ks—盐析常数，图中直线斜率 Cohn经验式蛋白质溶解度与盐浓度的关系 等电点沉淀法 原理： 调pH至等电点，使蛋白质所带净电荷为零，降低了静电斥力，而疏水力能使分子间相互吸引，形成沉淀。 适用于疏水性较强的蛋白质 pH=pI 等电点沉淀法 （1）适用于疏水性强的蛋白质 （2）中性盐浓度增大时，等电点向偏 酸方向移动，同时最低溶解度会有所增大。 （3）无机酸通常价格便宜，无毒 （4）蛋白质对低pH 敏感，易失活 操作注意事项 等电点沉淀实例 从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI＝8.9，可先于pH 3.0左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质(pI=3．O)。 工业生产胰岛素(pI＝5.3)时：先调pH至8.0除去碱性蛋白质，再调pH至3.0除去酸性蛋白质(同时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)。 等电点沉淀法 细胞色素C洗脱液（离交）+ 硫酸胺（饱和度86%） 低温离心 上清液调 pH4.8- 5.1 产物↓ 沉淀（杂蛋白） 有机溶剂沉淀法 概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。 优点在于：1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2）沉淀不用脱盐，过滤较为容易； 缺点是1）对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，2）操作要求在低温下进行。3）成本高 A 降低溶剂介电常数. B 破坏水化膜： C 相反力： 有机溶剂沉淀法机理 减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力， 从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏水化层 疏水基团暴露并有机溶剂疏水基团结合形成疏水层 降低介电常数 破坏水化膜 常用的有机溶剂沉析剂 选择依据： 水溶性要好 介电常数要小 致变性作用要小（甲醇） 毒性要小、挥发性适中 容易获取 　沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。乙醇是最常用的沉淀剂 乙醇：