间隙连接蛋白43表达下调对血管内皮细胞和炎症反应的作用-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

摘要 摘要 I I 摘要 近年来研究发现，间隙连接蛋白 43（connexin43，Cx43）的表达与皮肤伤 口愈合关系密切。皮肤创伤后，伤口内部及其周围组织中 Cx43 的表达瞬时下调， 可以加快皮肤伤口愈合的速率，提高伤口愈合的质量。参与皮肤伤口修复的细 胞主要有三种：成纤维细胞、角质形成细胞和血管内皮细胞。有关 Cx43 与伤口 愈合分子机制的研究表明：Cx43 表达下调可以加快成纤维细胞、角质形成细胞 的迁移速率，提高成纤维细胞和角化形成细胞增殖能力及角化细胞的分化能力。 但 Cx43 是否影响血管内皮细胞的功能尚不清楚。已知血管内皮细胞会参与 皮肤伤口愈合的整个过程。在炎症阶段，白细胞需要渗漏穿过毛细血管内皮层， 到达创伤部位引发炎症反应。而在增殖阶段，血管内皮细胞是伤口处血管新生 的主要细胞，新生血管可以为伤口区域细胞的迁移、增殖提供氧气和营养物质。 基于血管内皮细胞对伤口愈合的重要性，本文研究分析 Cx43 下调对于血管内皮 细胞功能的影响。 人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）是最常用的血管内皮细胞模型，而且它 对包括炎症因子在内的多种体内因子均具有良好的反应性。因此，本文选择 HUVECs 作为体外研究模型。 小干扰 RNA（siRNA）能够特异性减少蛋白在细胞中的表达。根据 Cx43 基 因序列，本课题组设计了三种 siRNA 序列（Cx43 siRNA 1，Cx43 siRNA 2，Cx43 siRNA 3）。通过 Western blot 实验筛选沉默效果最佳的 siRNA 序列及 siRNA 最 佳作用时间，结果表明 siRNA 作用 HUVECs 24 h 后，Cx43 沉默效率达到最大， 并有效维持最佳沉默效果达 72 h 以上。三种序列中，Cx43 siRNA 1 沉默效果最 佳，作用 24 h 时，即可使 HUVECs 内 Cx43 的表达降低约 80%。因此，本课题 选择 Cx43 siRNA 1 作为特异性减少 Cx43 的 siRNA 序列，作用 24 h 作为最佳作 用时间，研究 Cx43 的表达下调对 HUVECs 细胞间通讯、增殖、迁移、以及血 管生成活性的影响。实验结果表明 HUVECs 中 Cx43 蛋白表达下调后，HUVECs 细胞间信号传递功能减少约 65%，细胞活力、增殖和迁移活性显著降低、血管 生成速度减缓。 炎症阶段是影响创伤愈合速率和质量的重要阶段。炎症反应的发生需要经 历白细胞贴壁、粘附、穿越血管内皮细胞层的过程。白细胞与内皮细胞之间的 华侨大 华侨大学硕士学位论文 II II 粘着及白细胞渗出内皮细胞层是炎症反应的必经阶段。因此，本课题继续研究 HUVECs 中 Cx43 下调，对单核细胞 U937 与 HUVEC 之间粘着，以及 U937 穿 过 HUVECs 细胞层能力的影响。肿瘤坏死因子 α（TNF-α）可以刺激 HUVECs 呈现炎症状态，因此，本文使用 TNF-α 刺激 HUVECs，以模拟体内炎症状态。 Calcein-AM 标记 U937 法及活细胞虎红染色法实验结果表明，TNF-α 刺激 HUVECs 后，HUVECs 对 U937 的粘附能力增加，HUVECs 确实能够达到炎症状 态。HUVECs 中 Cx43 蛋白下调后，U937 与 HUVEC 之间的粘附能力明显降低。 filter inserts 实验结果表明 U937 迁移穿过 HUVECs 细胞层的数目减少。 本课题进一步进行分子机制研究。已知粘着分子在白细胞与内皮细胞的粘 附过程中起到至关重要的重要，本研究通过 Western blot 及 rt-PCR 分析 HUVECs 中 Cx43 下调对粘着分子表达的影响，发现 Cx43 蛋白下调后，HUVECs 中粘附 分子细胞间粘附分子（ICAM-1）、血管粘附分子（VCAM-1）表达下调，而 CD44 表达基本没有变化。 以上的研究表明，伤口处 Cx43 表达下调，会通过影响血管内皮细胞生物学 特性，包括降低细胞间隙连接交流、增殖、迁移、血管形成能力，以及通过降 低血管内皮细胞中粘附分子的表达，减少白细胞与血管内皮细胞的粘附，进而 降低炎症反应的强度，提高伤口愈合速率、改善伤口愈合质量。 关键词：间隙连接蛋白 43 伤口愈合 血管内皮细胞 白细胞 粘着分子 Abst Abstract PAGE PAGE VI Abstract In recent years, the gap junction protein connexin43 has been shown to play a pivotal role in wound healing process. If downregulate the expression of