药物的抗病毒实验安徽医科大学.pptVIP

第六节 药物的抗病毒实验 一、目的和要求 1.掌握药物体外抗病毒的实验方法和操作步骤。 2.熟悉病毒感染性动物模型的建立和评价。 二、内容 （一）原理 病毒是一类结构简单、非细胞形态的专性细胞内寄生的微生物，必须在易感的活的动物、鸡胚或细胞内才能进行复制增殖。因此可用动物、鸡胚或细胞来进行病毒培养和药物的抗病毒试验。可通过观察细胞培养液酸碱度的变化、病毒致细胞病变效应（CPE）、病毒滴度（PFU）改变、病毒基因组mRNA水平变化、鸡胚尿囊液或动物血清等相应指标的改变，来判断药物的抗病毒试验效果。 （二）材料 1. 9~10 d日龄鸡胚，壳白净且厚薄均匀的鸡卵（莱亨鸡的受精卵由于卵壳薄，在孵育过程中便于检查，为首选） 2. Hep-2细胞或MDCK细胞 3.病毒：如IFV（FM1株）、RSV（Long株） 4.药物：试验药物，阳性对照药 5.动物：小鼠等 （三）操作方法 鸡胚培养为常用的病毒培养法之一，目前主要用于痘类病毒、粘病毒、疱疹病毒的分离、鉴定、制备抗原和疫苗的生产等。 1.接种方法 病毒的鸡胚培养法主要有四种接种途径，即尿囊腔、绒毛尿囊膜、羊膜腔和卵黄囊，不同的病毒应选择各自适宜的接种途径，并根据接种途径确定鸡胚的孵育日龄（见表）。下面将以流感病毒为例进行说明。 表6-1????鸡胚孵育日龄及接种途径选择 2. IFV-FM1的50%鸡胚感染量（EID50）测定 用生理盐水将病毒作10倍系列稀释，分别接种鸡胚，0.1ml /胚，同时设正常对照，共6组，每组5胚。35℃孵育72 h，置4℃冰箱过夜，收集尿囊液做血凝试验，按Reed-Muench法计算FM1的EID50。 3. 药物对鸡胚的毒性作用 选用健康的9~11日龄鸡胚，消毒备用。将受试药和对照药作10倍系列稀释5~6个浓度，如100mg/ml、10mg/ml、1mg/ml、100μg/ml、10μg/ml，每个浓度接种5胚，0.25ml /胚。35℃培养5 d后观察结果（死亡/存活）。确定两种药物对鸡胚的最大无毒剂量（TC0），用于正式实验。 4. 药物对FM1的抑制作用 鸡胚随机分为14组，每组5胚，即试验药的六个剂量组（从TC0开始作10倍系列稀释）、阳性对照药六个剂量组（同前）、生理盐水和病毒对照组。将不同浓度的药液注入鸡胚中，0.25ml /胚，30 min后经相同途径注入100 EID50病毒0.1ml，对照组以生理盐水代替。35℃温箱孵育5 d。收获尿囊液，测其血凝效价，以能抑制32倍以上所注射的最小药物量，即为其最小抑制剂量（MIC）。 4.1鸡胚接种 （1）孵育9~10 d左右的鸡胚，在照蛋灯下用蜡笔标出气室和胎位。 （2）鸡胚直立于固定架上，气室端向上，按常规以碘酒，酒精消毒。 （3）用磨蛋器在气室中央磨一小孔，再用碘酒擦拭。 （4）用lml注射器吸取病毒悬液，针头从气室小孔刺入，沿胚胎的长轴刺入0.5~1.0cm深度；此时针头已在尿囊腔中，注入0.2ml病毒悬液。 （5）拔出针头，用镊子将胶布沾酒精烧灼后将小孔封闭，置于35~36℃温箱内培养二天，每天翻动两次，用照蛋灯检视一次。培养二天后。置 -20℃冰箱2 h后，无菌操作收获尿囊液。 4.2尿囊液的收获 （1）从冰箱中取出鸡胚，用碘酒，酒精消毒气室部位。 （2）用无菌镊子除去胶布并去除气室部分的卵壳。 （3）用无菌的毛细吸管插入尿囊腔中轻轻吸取尿囊液（避免血管破裂），置于无菌试管中。 （4）获得的尿囊液取一部分做血凝和血凝抑制试验（定性），判断病毒的增殖情况并对病毒进行鉴定；同时做无菌实验。 4.3血凝和血凝抑制实验 （1）血凝实验 血凝实验的具体操作方法，参照本教材的第四章第四节内容：病毒的分离培养鉴定和血清学检测。 [结果判断] 以“+”号多少表示血凝程度： ++++ 100％的RBC发生血凝，形成花边拉网状，红细胞呈薄层均匀铺于板孔底，呈细沙状或薄膜状； +++ 75％的RBC发生血凝，红细胞虽铺于孔底，呈细沙状，但边缘不整有下沉趋势； ++ 50％的RBC发生血凝，红细胞在孔底呈一环状，四周有小凝集块； + 25％的RBC发生血凝，红细胞在孔底沉聚呈小圆点，边缘不光滑，周围有小凝集块； - 100％的RBC沉积，红细胞于孔底呈一小圆点，边缘光滑整齐，无凝集现象。 以使50％的RBC发生凝集的最高稀释倍数，为病毒的血凝效价。计算药物的MIC。 （2）病毒血凝抑制实验 根据血凝试验滴定的病毒血凝效价，以“2＋”的凝集者含有1个病毒血凝单位。如流感病毒的血凝效价为1:160，即病毒液稀释至1:160时，每0.25ml中含1个血凝单位，若要将0.25ml病毒液