免疫分析法PPT幻灯片.pptVIP

ELISPOT发展历史 1963年：Jerne等人创立的溶血空斑技术(hemo-lytic plaque forming cell assay ,HPF),这项技术可用于检测并计数单个抗体形成细胞。 1983年：Czerkinsky 等成功地检测出因受刺激而分泌抗体的B细胞频率 接近体内实验的环境，藉由检测T细胞分泌的各类细胞因子，来定量机体内免疫反应启始者Precursor T亚群的大小，预测体内免疫系统即将进行的下游免疫反应。 1996：俄亥俄卅Case Western Reserve大学Paul Lehmann团队引进PVDF薄膜的应用（Forsthuber et al., Science, 1996），解决了低敏感度的问题。 Nordstrom 等用生物素-抗生物素蛋白生物放大法来提高这种方法的敏感性 Herr用计算机辅助图像分析系统(computer-assisted video image analysis ,CVIA) 自动分析TNF-α酶联免疫斑点的大小和数量,计算与负载抗原肽的靶细胞接触后PBMC中抗原特异性CD8+T细胞的数量 Vaquerano等将数码相机和计算机结合起来,开发出类似的斑点计数系统,认为当每孔斑点数大于100时,这种方法更客观、可重复性高且节省时间 检测原理 细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后， 被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。底物孵育后， PVDF 孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过显微镜或ELISPOT 酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。 ELISPOT标准操作程序 D1 ELISPOT包被程序 每孔加入15μl 70%的乙醇预湿30秒，PVDF膜变成半透明状（加样注意！） 加入100μl去离子水洗涤三次，尽量减少乙醇的残留 每孔加入100μl包被抗体工作液，4°C包被过夜 ELISPOT标准操作程序 D2 倾倒包被液，用PBS洗涤5次，最后一次，在灭菌的吸水纸上扣干 200μl试剂盒自带的稀释好的封闭液，37°C封闭1小时 倾倒封闭液，无须洗涤，直接可以进行细胞培养。（也可以用PBS缓冲液或者纯水洗涤一次，拍干，封口，4°C保存，可以在4°C保存数周。） 以上迁改数量均为施工图评审确定的数量，项目具体内容详见相关设计图纸。乙方需按批准施工图完成各杆线线路及设施安装、征地及青苗补偿、验收资料等工作。 细胞因子检测方法 基础医学院微免学系 王慧娟 背景 细胞因子检测是判断机体免疫功能的一个重要指标 疾病的诊断、病程观察、疗效判断及细胞因子治疗监测等 （一）依赖性细胞株 ：生物分析法 （二）功能检测 ：生物分析法 （三）免疫测定 ：免疫分析法 （四）功能测定与抗体抑制 （五）分子杂交技术 ：mRNA的测定 （六）多聚酶链反应技术（PCR）：mRNA的测定 生物分析法 （一）依赖性细胞株 　　一些肿瘤细胞株必须依赖于细胞因子方能在体外增殖，如DTLL细胞株依赖IL-2；FDC-PL细胞株依赖于小鼠IL-3；TF-1细胞株依赖于人IL-3和人GM-CSF，因而可利用这些依赖细胞株检测相应的细胞因子。这种方法敏感性高，特异性也不错，但可异的是并非所有细胞因都能找到相应的细胞株，因而限制了它的应用。 （二）功能检测 利用一些细胞因子的功能特性，可建立相应的活性测定方法，如干扰素的抑制病毒感染效应，肿瘤坏死因子对L929细胞的杀伤作用等。这样的方法敏感性高，但特异性不够，容易受一些扰因素的影响。 免疫分析法 （1）放免实验（RIA） （2）酶联免疫吸附实验（ELISA） mRNA的测定 （1）分子杂交实验 （2）逆转录PCR（RT-PCR） 小结 生物学检测法比较敏感，又可直接测定生物学功能，是最可靠的方法，适用于各种实验目的，是科研部门最常用的技术，但需要长期培养依赖性细胞株，检测耗时长，步骤繁杂，影响因素多，不容易熟练掌握。 免疫学检测法比较简单，迅速，重复性好，但所测定的只代表相应细胞因子的量而不代表活性，同时敏感度也低于生物活性检测法（约低10～100倍）。 分子生物学法只能检测基因表达情况，不能直接提供有关因子的浓度及活性等资料，主要用于机制探讨。 影响因素 原理与方法 灵敏度 准确度和特异性 精密度 ：免疫分析法的精密度较其生物分析法有较大提高 ；批内变异通常为20%～25%，因此有必要进行2次或3次检测 标准化 生物分析法和免疫分析法结合使用 免疫分析法 ELISA 细胞内细胞因子的流式细胞仪检测 ELISPOT ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay 1． 间接EL