课件：实验二血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳.ppt

5.染色： 电泳完毕后将薄膜取下, 放在含氨基黑10B染色液的培养皿中浸泡5min，染色时可置于摇床，染色液用后回收到原瓶。 6.漂洗： 将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次，直至背景蓝色脱尽，条带清晰为止，取出薄膜放在滤纸上，用吹风机冷风吹干或者自然晾干。 7.透明 将干燥的薄膜浸入透明甲液2min后转入乙液1min，取出后贴于干净玻璃板上，中间不能有气泡，等待至薄膜透明，如果透明太慢可用乙液淋洗一次。透明后冷风吹干燥，置于自来水下冲洗，等薄膜湿润后用刀片从一角撬开并轻轻取下，滤纸吸干水分后即可。如需长期保存可在液体石蜡中浸润。 8.记录和分析实验结果 透明后可将薄膜上的5条色带根据其颜色深浅、形状、大小及相对位置进行描述、记录，并判断分析结果。透明后的薄膜可作扫描或照相。 正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图 1．为清蛋白，2，3，4，5，分别为α1—，α2—，β—，及γ—球蛋白，6为点样原点 注意事项 1、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。 2、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，薄膜吸水量以不干不湿为宜。 3、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏薄膜或印出凹陷影响电泳区带分离效果。 4、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或过少。 5、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样面向下。 6、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进行复染。 思考题 1.用醋酸纤维薄膜电泳做电泳支持物有什么优点？ 2.电泳时为什么要将点样的一端靠近负极端？ 3.电泳图谱清晰的关键是什么？如何正确操作？ 小知识：血清蛋白电泳结果的临床意义 可能相关疾病 清蛋白 α1球蛋白 α2球蛋白 β球蛋白 γ球蛋白 骨髓瘤 ↑* 肾病综合症 ↓ ↑* ↑* 肾炎 ↑* ↑ 肝硬化 ↓ ↑* 急性肝坏死 ↓* ↑ ↑ ↑ ↑ 传染性肝炎 ↓ ↑* ↑* 急性感染初期 ↑* ↑* ↑* 慢性炎症/感染后期 ↑* 低?球蛋白血症 ↓* THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 * * 可编辑 可编辑 实验二 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 （Cellulose acetate membrane electrophoresis of serum proteins） 实验目的 1、掌握电泳法分离蛋白质的原理 2、学习醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的 原理和操作方法 3、学习蛋白质染色的方法 分离蛋白质的方法 分离方法 沉淀法 盐析法 有机溶剂沉淀法 层析法 电学法 电泳法 等电聚焦 超速离心法 离子交换层析 吸附层析 凝胶过滤（分子筛） 亲和层析 实验原理 电泳：是指带电粒子在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。 在一定pH条件下，不同的蛋白质由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可对它们进行分离。 以蛋白质为例： H＋ OH－ H＋ OH－ pHpI pH=pI pHpI 影响电泳迁移率的因素： 1、内在因素：蛋白所带净电荷的性质和电荷的量、蛋白的大小和形状 2、外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离 子强度和电渗现象 常见的电泳有： 1、醋酸纤维膜电泳、 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳、 3、毛细管电泳 负极 正极 － － － － － － － － 表面带负电荷 带正电荷的水层携带粒子向负极移动 如果样品原本是移向负极的，则泳动的速度加快； 如果样品原本是移向正极的，则泳动的速度减慢。 电渗作用： 电渗：在电场作用下液体对固体支持物相对移动的现象。 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 以纸电泳为例: 血清中几种主要蛋白组分： 血清蛋白质　　　　　　　　　　 等电点 分子量 占总蛋白的％ 清蛋白　　　　 　　　　　　　　 4.64　 69,000 57～72 α1－球蛋白　　 　　　 　　　　 5.00　 200,000 2～5 α2－球蛋白　　　　　　　　　 　　　 5.06 300,000　 4～9 β－球蛋白　　　 　　　 5.12 90,000～150,000　　 6.5～12 γ－球蛋白　　 　　　 6.85～7.3 156,000～950,000 12～20 缓冲液pH=8.6 pI＜pH 血清蛋白带负电荷,在电场中向正极移动 醋酸纤维薄膜电泳 醋酸纤维薄膜作