微生物细胞的破碎.pptVIP

超声波破碎时，影响生物产品收率的因素： 1、温度上升 当气泡破裂时，绝大部分释放出来的能都以热的形式为液体所吸收，为了避免高温，悬浮液应预先冷却到0－5C，并且还应用冷却液连续通入容器夹套，即短期的声波破碎与短期的冷却交替操作，声波破碎/冷却的时间比率称为 “负载因素”。 2、化学效应 超声处理会引起诸如生成游离基这样的化学效应，它可能对某些需要的分子带来破坏性影响，但对破碎细胞毫无影响。 可通过添加游离基清除剂如胱氨酸或谷胱甘肽，或者用氢气预吹细胞悬浮液来缓和。 由一个带夹套的烧杯组成，其形状和尺寸会影响悬浮液的流体动力学。对于刚性细胞可以添加细小的珠粒，产生辅助的研磨效应。超声波反应器内，有四根内环管，由于声波振荡能量会泵送悬浮液循环，用插入进出口管到内部烧杯去的方法，就可以实现连续操作。 连续超声波破碎的实验室装置 影响超声波破碎效率的参数: (1)、振幅 振幅直接与声能有关，影响蛋白质释放的比速度 k。 (2)、细胞悬浮液的粘度 粘度影响能耗并会抑制空穴现象。 (3)、表面张力 添加表面活性剂或从细胞中释放出表面活性物质(如蛋白质)，能显著地影响声波破碎效率。 因为强烈起泡在气一液界面上会促使蛋白质变性和空穴清除，特别是应用高的功率时。 (4)、被处理悬浮液的体积 大体积需要高的声能引起强烈涡流和大气泡形成。 (5)、珠粒的体积和直径 添加细小的珠粒，玻璃或者钢制的，不仅对空穴的形成有帮助，而且产生辅助 “研磨”效应，从而提高破碎效率。 在相同珠粒填充密度下，随着珠粒直径的变化，k存在最大值。 (6)、探头的形状和材料 对于一个能级恒定的功率，探头的振幅与其面积成反比，然而对于小直径的探头，声能限制在较小的区域并且效率低。特别是当悬浮液的体积小的时候，能量在探头嘴附近被悬浮液吸收，强烈的涡流会变小。对于大的探头，声能消耗在大范围上，结果则使振幅更小。 探头嘴通常用钛制造，因为钛具有良好的声学和机械特性以及对生物活性产物的低毒性。为了维修和替换，通常探头可以拆卸。除钛以外，还可使用其他材料如不锈钢或硬质钢，但是其声学和机械特性都不如钛，破碎速度也大幅度降低。 (7)、细胞悬浮液的流速 在连续操作中，流速取决于细胞在反应器中的停留时间，并影响破碎的总收率。 声波破碎在实验室广泛应用，但在工业范围中还未采用这种方法，因为要向大量细胞悬浮液中通入足够的能量是很困难的。 （二）、非机械方法 酶解 渗透压冲击， 冻结和融化 热处理、 化学法溶胞 原理：利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破壁目的。 A. 酶解法 优点: 产品释放的选择性高; 抽提的速率和收率高; 产品的破坏最少; 对pH值和温度等外界条件要求低; 不残留细胞碎片。 缺点： 广泛应用受酶的费用限制。若在超滤反应器中使用可溶性固定化酶可望解决酶的费用问题。 单一酶不易降解细胞壁，需要选择适宜的酶及酶反应系统，确定特定的反应条件，并结合其他的处理方法，如辐照、加入高浓度盐及EDTA，或利用生物因素促使生物对酶解作用敏感等 如果是酵母细胞的破壁，至少有两种酶是必需的，即细胞壁－溶解蛋白酶和β(1-3)葡萄糖酶，但是β(1-6)葡萄糖酶，甘露糖酶和甲壳素酶将加速这一溶解过程。 对于细菌，糖苷酶、N一乙酞胞壁酰-L一丙氨酸酰胺酶和多肽酶的混合物将加速肽聚糖的溶解。在破碎革兰氏阴性菌时，为了去除外部双层脂质需要用表面活性剂进行预处理。 除上述外，可采用的酶还有其他类型的蛋白酶、脂肪酶、溶菌酶、核酸酶、透明质酸酶等。 应用最多，专一地分解肽聚糖的?－1，4糖苷键，经溶菌酶处理后的细胞移至低渗溶液中使细胞破裂。 溶菌酶： 原理：微生物代谢能产生一种能水解细胞壁上聚合结构的酶，以便使生长过程进行下去。可是，改变微生物的环境可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶的目的。 影响因素：有温度、时间、pH缓冲液浓度、细胞代谢途径等。 方法：微生物自溶常采用加热法或干燥法。 B. 自溶法 举例： 1、谷氨酸产生菌，可加入0.028mol／L Na2CO3和0.018mol／L NaHCO3 ，pH10的缓冲液，使成3％的悬浮液，加热至70C，保温搅拌20分钟，菌体即自溶。 2、酵母自溶温度需在45—50C下保持12—24小时。 自溶法在一定程度上能用于工业规模，但是，对不稳定的微生物容易引起所需蛋白质的变性，自溶后的细胞培养液过滤速度也会降低。 采用抑制细胞壁合成的方法能导致类似于酶解的结果。 某些抗生素如青霉素或环丝氨酸，能阻止新细