DNA的测序法、原理及其应用.pptVIP

DNA的测序方法、原理及其应用 一、DNA序列测定概述及其发展 1963年，Sanger和Thompson等人第一次完成胰岛素51个 氨基酸的序列测定，这在当时来说是一件了不起的大事。70 年代后期，Sanger和MaxamGilbert等人又建立了核酸序 列测定的方法，Sanger双脱氧末端终止法和Maxam Gilbert化学裂解法将核酸序列测定技术推进到“直读”阶段， 使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易，这样 人们可以通过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序 列。 二、测序的常用方法 1）双脱氧链终止法测序(the chain termination method) 基本原理： 通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链，由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而来读取待测DNA分子的顺序。 用于终止反应的双脱氧核苷酸： 将2’ ，3’ –双脱氧核苷酸（ddNTP）参入到新合成的DNA链中，由于参入的ddNTP缺乏3’ –羟基，因此不能与下一位核苷酸反应形成磷酸二酯键，DNA合成反应将中止。 2）Maxam-Gilbert 化学降解法测序 基本原理： ① 用放射性核素标记待测DNA一侧末端 ② 将标记DNA分为G、A+G、C+T、C 4个反应体系 ③ 用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂DNA片段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为放射线标记的末端，另一端为不同大小的DNA片段的混合物 ④ 电泳分离，放射自显影得到互相错落的梯形图谱，即可读出DNA序列 3） DNA自动化测序 特点 原理同末端终止法 标记物为荧光染料 激光扫描自动测序 结果清晰、准确、分辨率高 测序速度快 200bp/h Maxam-Gilbert法只需简单化学试剂。所测序列来自原DNA分子而不是酶促合成反应所产生的拷贝，因此利用化学法可以对合成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲基化等DNA修饰的情况。但所能测定的长度要比Sanger法短一些，它对放射性标记末端 250个核苷酸以内的DNA序列效果最佳。 Sanger 法虽需要单链模板和特异寡核苷酸，并需获得大肠杆菌DNA 聚合酶IKlenow 片段的高质量酶制剂，而随着M13 噬菌体和噬菌粒载体的发展，也由于现成的合成引物容易获得及测序反应日期完善，双脱氧链终止法如今远比Maxam-Gilbert法应用得广泛。 由于Sanger法既简便又快速，目前大多数测序策略都是为Sanger法而设计的。 DNA自动测序与手工测序的不同点 1）标记物不同：手工测序采用放射性核素标记，而自动测序采用4种荧光染料分别标记ddNTP或标记引物 2) 加样方式不同：手工测序，一个样品的4个测序反应物分别在不同泳道进行，而自动测序可在一个泳道内电泳 3) 检测手段不同：手工测序采用放射自显影，从4种寡聚核苷酸的梯子形图谱中读出DNA序列，而自动测序则采用激光扫描器同步扫描，计算机进行阅读和编辑 氨基酸序列同源性分析 碱基序列同源性 分子进化树分析亲缘性关系 * * 即核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项重要的技术。 　　 其基本原理是DNA?的复制反应体系中需要存在DNA?聚合酶、DNA?模板、寡核苷酸引物和dNTP，引物和模板退火形成双链后，DNA?聚合酶在引物的引导下在模板链上沿3’→5’的方向移动，dNTP?按照碱基配对原则，逐个连接在引物的3’-OH?末端。 DNA序列测定常用方法有如下3种： 1、高负荷，1块胶可测16个样品；2、机读不需放射自显影；3、安全不用同位素；4、简单迅速8-10h。 不需酶促反应，可以对寡核苷酸测序。 简便、迅速、应用广泛。 优点 类似末端终止法，所不同的是用荧光染料标记，计算机自动读出。 用化学试剂在A、G、C、T处特定的裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，经过PAGE放射自显影可直读DNA顺序。 使用特异性引物与单链模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，用ddNTP终止，用PAGE区分长度仅相差1个核苷酸的ssDNA，从而完成测序的方法。 3、DNA测序自动化 2、化学裂解法 1、末端终止法 O 碱基 C P O H 1 2 3 4 5 O 碱基 C P H H 1 2 3 4 5 H2O 脱氧核苷酸的连接 O 碱基 C P H H 1 2 3 4 5 O 碱基 C P OH H 1 2 3 4 5 OH X 双脱氧核苷酸… ? 表特异断裂4种脱氧核苷酸的方法 同上，只在C处断裂DNA链 2MNaCl，联氨处理方法同上，100分钟，此时，T的破坏被抑制，只有C