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基因工程综合性教学实验 大肠杆菌碱性磷酸单酯酶基因 克隆 表达 纯化 吴海珍 王善利 赵健 俞建瑛 张惠展 华 东 理 工 大 学 应用生物学系 二○○五年一月 第一部分 碱性磷酸单酯酶基因的 定位、克隆与表达 实 验 流 程 图 碱性磷酸单脂酶基因在染色体DNA上的杂交定位――Southern Blotting 碱性磷酸单脂酶基因的体外扩增――PCR扩增 PCR体外扩增片段的克隆连接于T-载体――连接 连接产物转化大肠杆菌受体菌――转化 转化子质粒DNA的抽提――快速法制备质粒 转化子的鉴定――限制性内切酶酶切 目的转化子DNA的大量制备――碱法抽提质粒DNA 酶切回收克隆的目的基因片段――回收目的基因 重组表达型质粒的构建――连接、转化、鉴定 重组大肠杆菌目的蛋白的表达――蛋白电泳 实 验 路 线 1 DNA的酶切 摘要 本单元主要介绍限制性核酸内切酶的各种特性、酶的保存方法和使用注意点，多种酶联合酶切的常用策略等。 1.1实验原理 DNA重组技术中的第一步是从不同来源的DNA（染色体DNA或质粒DNA）上将待克隆的DNA片段特异性切下，同时在载体DNA分子（一般为质粒DNA）上打开相对应的缺口，然后将两者连接成重组DNA分子。这一特异性的切割过程常由特定的限制性核酸内切酶来完成。 限制性核酸内切酶几乎存在于任何一种原核细菌中，它能在特定位置上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段。早在20世纪50年代初微生物体内的限制核修饰作用就已发现，10年后细菌的限制和修饰作用的分子机制被阐明。以大肠杆菌为例，在K株和B株中都含有各自不同的限制――修饰系统，两种不同来源的－噬菌体（?K和?B）长期寄生于各自的宿主细胞中，宿主细胞内的甲基化酶已将其染色体DNA和噬菌体DNA特异性的保护，封闭了自身所产生的限制性核酸内切酶的识别位点，故它们在感染相应的宿主细胞（K株和B株）时DNA不被降解，因此感染频率很高。当它们分别感染其他宿主细胞时，由于没有特异性的保护作用，入侵的DNA分子被宿主细胞的限制性内切酶切割降解，从而感染频率急剧下降，普遍能低一或几个数量极。这一现象普遍存在与原核细菌中。但由于宿主细胞内的降解作用的不完全，入侵的DNA分子总有极少数能完整保留下来并得以在细胞体内复制，而且在复制过程中被宿主细胞的甲基化酶所修饰。这修饰过的DNA分子再重新制备后导入该宿主细胞时，感染频率又能恢复到原来的高位，即限制――修饰作用被解除。 1.1.1限制性核酸内切酶的分类 目前在细菌中发现有600多种限制性核酸内切酶，根据其性质不同可分为三大类（见表1-1）。其中II类限制性核酸内切酶与其所对应的甲基化酶是分离的，不属同一酶分子，而且由于这类酶的识别切割位点比较专一，因此广泛用于DNA的重组实验。I类和III类酶严格地说应该称为限制――修饰酶，因为它们的限制性核酸内切活性及甲基化活性都作为亚基的功能单位，包含在同一酶分子中。 表1-1各类限制性内切酶的特性 I类酶 II类酶 III类酶 酶分子 三亚基双功能酶 内切酶和甲基化酶分开 二亚基双功能酶 识别位点 二分非对称序列 4～6bp短序列， 大多数为回文结构 5～7bp非对称序列 切割位点 距离识别位点至少 1 000bp，无特异性 在识别位点中 或靠近识别位点 在识别位点下游24～26bp处 限制性反应与甲基化反应 互斥 分开的反应 同时竞争 限制作用所需的辅因子 ATP、Mg2+、 S-腺苷甲硫氨酸 Mg2+ ATP、Mg2+、S-腺苷 甲硫氨酸（非必需） DNA重组中的用途 无 有 无 1.1.2 II类限制性核酸内切酶的基本特性 II类限制性核酸内切酶是Smith等人于1968年在流感嗜血杆菌d型菌株中发现的。该类酶是一种分子量较小的单体蛋白，其双DNA的识别与切割活性仅需要Mg2+，且识别与切割位点的序列大都具有严格的特异性，因而在DNA重组实验中广泛使用。 目前已分离出400余种II类限制性核酸内切酶，鉴定识别及切割位点的有300多种，商品化的酶NEB（New England Biolabs）公司品种最多，达220余种，其中在DNA重组实验中常用的有20多种。这些酶的统一命名由酶来源的生物体名称缩写构成（见图1-1） 图1-1 限制性内切酶的命名原则与示例 1.1.2.1识别位点 II类限制性内切酶的识别位点具有180°旋转对称的回文结构，常用的识别序列往往为6个碱基对，例如HindIII的识别序列： 其中一部分的识别序列某一或某两位碱基并非严格专一，但都在两种碱基中具有可替代性，这种不专一性并不影响内切酶和甲基化酶的作用位点，只是增加了DNA分子上的酶识别与作用频率，例如AvaI的识别序列就是典型的结构：