生物专业技术本科发酵工程实验讲义.docVIP

PAGE 9 - 实验报告样式： 实验名称：地衣芽孢杆菌生物制剂的发酵 专业：年级： 姓名：学号：实验组号：组内编号 实验目的 实验原理 实验材料及仪器设备: 实验材料名称，仪器名称及主要规格、器皿名称及规格等。 实验内容：对一些实验，根据要求列出实验步骤 实验记录：记录实验数据，写明物理量和单位，并注意有效数字保留； 实验结果：数据处理及结果表示（可用图表等形式）。 讨论及体会：对实验中获得的新认识、新体会、存在的问题、进一步的想法等进行讨论。 发酵工程实验日程表 序号 实验工程 时间 实验内容安排 1 培养基制备与灭菌 预计8学时 固体培养基配制500ml/组，分装2瓶； 培养皿清洗及包扎15副/组；无菌水100ml/瓶； 吸管包扎4支/组； 液体培养基制备：800ml/组，分装16瓶，灭菌0.1MPa,20min. 2 菌种活化与种子制 预计3学时 1、菌种的分离纯化:超净工作台消毒（UV照射20min）→75%乙醇擦拭台面；活性菌剂→无菌水溶解(稀释10-2倍)→涡旋震荡5min；倒平板(10副平皿/组)→平板划线分离→30℃ 2、接种准备工作：超净工作台消毒（UV照射20min）→75%乙醇擦拭台面。 种子培养接种：平板单一菌落→种子培养基（2环/瓶）→涡旋震荡3-5min； 摇瓶培养：摇床设置及调节（30℃，200r/m）→摇瓶固定→ 3 发酵罐结构、操作规程及分批发酵 预计 8学时 发酵培养基配制：18L。 发酵罐操作培训：发酵罐初始状态检查及调节→清洗（清水冲洗2-3遍）→发酵罐运行启动→发酵罐运行参数设置→空罐灭菌（0.15MPa,20min）→进料→实罐灭菌（0.1MPa维持30min）→冷却→火焰封口接种→发酵参数稳定状态调节与维持。 发酵取样：取样管灭菌→取样→再灭菌； 发酵中间过程分析（0 hour）： pH测定（pH计or精密试纸）；酸度（中和法）；残糖测定（折光法）；菌体浓度测定（A600光密度法） 中间取样：每间隔4h, 取样管灭菌→取样→再灭菌.共计4-6次 ； 4 形态观察、细胞的分离提取 预计 5学时 显微观察 地衣芽孢菌剂灌装及包装 发酵结束工作：器皿、设备还原，环境清洁 0简况 地衣芽孢杆菌细胞形态为杆状，呈单生排列，其活菌形式进入人或动物肠道后，对葡萄球菌、酵母菌等致病菌有拮抗作用，而对双岐杆菌、乳酸杆菌、拟杆菌、消化链球菌有促进生长作用，可促使机体产生抗菌活性物质，杀灭致病菌。此外，地衣芽孢杆菌通过夺氧生物效应可以使肠道缺氧从而有利于大量厌氧菌生长，是一种重要的微生态调节剂，目前已大规模应用于“整肠生”等药品及其它保健制剂的制造生产。 由于地衣芽孢杆菌的代谢过程会受到营养基质、pH、温度、溶解氧等一系列外界条件的影响，因此选择合适的发酵条件对于菌剂的生产是非常必要的。本实验要求同学结合发酵工程基本知识，分离一株地衣芽孢杆菌，并对该进行发酵罐扩增，为该菌剂的液体发酵生产和应用提供的资料。 1材料方法 1.1 材料及设备 1.1.1增殖培养基 蛋白胨 10g/L，牛肉膏 3g/L，NaCl5g/L，pH值7.2。 1.1.2发酵培养基 可溶性淀粉15 g/L，酵母膏0.2 g/L，蛋白胨5.0 g/L，(NH4)2SO42.5g，KH2O42.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.025 g/L,CaCO30.05 g/L, 初始pH为7.2。 1.1.3 设备 可见分光光度计22PC(上海棱光技术有限公司)；振荡培养器(上海博迅实业有限公司)；超净工作台(苏晋集团安康公司)。机械搅拌通气式发酵罐（上海国强生物工程公司）。 1.2 操作方法 1.2.1 培养基配制 （1）计算　按固体培养基和液体培养基的配方，计算500mL固体培养基和800mL液体培养基各物质的用量。 （2）称药品　用砝码天平准确称量各物质。 （3）溶解　将培养基的组分放加在500mL烧杯的水中，玻璃棒搅拌溶解。（固体培养基琼脂在室温下不能溶解，需加热煮化）。 （4）分装　液体培养基每组按50L 培养基/250mL三角瓶规格分装16瓶；固体培养基分装250mL培养基/250mL三角 （5）包扎三角瓶口塞上瓶塞后用牛皮纸和线绳包扎，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。在纸上写上培养基名称、组别、日期。 （6）灭菌　放置于高压蒸汽灭菌锅内，121℃湿热灭菌30 （7）倒平板　待高压蒸汽灭菌锅降温至60℃ 【实验注意事项】 准确称量各物质，称完药品应及时盖紧瓶盖。调pH值时要小心操作，避免回调。不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。灭菌操作中务必待压力下降到零后，才可打开锅盖。 1.2.2 地衣芽孢杆菌分离 平板稀释分离法：菌剂1g溶解于100mL无菌水，再梯度稀释成10-3、10-4、10-5、10-6、10