抗新城疫病毒繁殖的短肽及其突变体基因的克隆和在大肠杆菌中的融合表达-生物化学与分子生物学专业毕业论文.docxVIP

抗新城疫病毒(NDV)繁殖的短肽及其突变 抗新城疫病毒(NDV)繁殖的短肽及其突变 体基因的克隆和在大肠杆菌中的融合表达 摘要 目白勺：化学合成抗新城疫病毒(NDV)繁殖的九肽二串联体 (Nonapcptide2)基因及其突变体(Nonapcptide2-M)基因，分别在大肠杆菌中 克隆和融合表达，为进一步研究两者的抗病毒活性奠定基础。 方法：根据文献报道的氨基酸序列，应用大肠杆菌偏爱密码子，设计 抗NDV繁殖的九肽(Nonapcptido)二串联体基因序列。对该九肽进行改造，将 6位赖氨酸置换为酪氨酸，同样选择大肠杆菌偏爱密码子，得到其突变体基因。 在基因两端分别加入限制性内切酶EeoR I和Sal I的酶切位点，在相邻 Nonapoptide间加入了蛋氨酸密码子，突变体同Nonapeptidc加入蛋氨酸密码子， 化学合成该九肽二串联体基因(Nonapcptide2)及其突变体基因 (Nonapcptid02一M)。将Nonapeptide2、Nonapeptide2·M分别与经历oR I和8al I 酶切后的克隆载体pUCl8连接、转化大肠杆菌DH5ct，经蓝白筛选，挑取阳性 菌落，抽提重组质粒，酶切、PCR鉴定并测序。酶切克隆重组体得到目的基因， 与经相同酶切后的表达载体pGEX．钉．1连接，转化大肠杆菌BL21，挑出阳性菌 落，抽提重组质粒，酶切、PCR鉴定并测序。将鉴定为阳性的茵落用IPTG 37(2 诱导表达GST融合蛋白2．5小时，SDS．PAGE电泳观察表达结果。收集含融合 蛋白的大肠杆菌BL21，使用GST融合蛋白纯化试剂盒裂解包涵体，纯化融合蛋 白，用凝血酶对融合蛋白进行切割分离。 结果： 1、分别将Nonapoptide2、Nonapeptide2-M克隆到载体pUCl8上，初步检 测、筛选阳性转化子，并测序，结果表明与预先设计的Nonapoptide2、 Nonapcptide2-M基因序列一致，克隆重组质粒构建成功。 2、构建了融合表达载体pGEX·4T-l与Nonapeptide2、Nonapeptidc2-M重 2、构建了融合表达载体pGEX·4T-l与Nonapeptide2、Nonapeptidc2-M重 组质粒，初步检测、筛选阳性转化子，进一步测序正确，可以进行诱导表达。 3、Nonapeptidc2、Nonapcptid02-M插入表达载体pGEX-4TIl后，经IPTG 诱导表达2．5h，SDS．PAGE电泳结果可见约29KD的融合蛋白条带．说明两条目 的基因得到融合表达。 4、收集分别含Nonapoptid02融合蛋白、Nonapoptide2-M融合蛋白的大肠 杆菌BL21，使用GST融合蛋白纯化试剂盒裂解包涵体，纯化、溶解融合蛋白， 用凝血酶切割融合蛋白，初步得到分别含Nonapeptid02蛋白及突变体 Nonapeptidc2-M蛋白的混合液。 结论：成功克隆了抗NDV繁殖的九肽二串联体(Nonapopfid02)及其突 变体(Nonapoptid02．M)基因，构建了两者的原核表达载体，在大肠杆菌中诱导 表达成功，并对表达融合蛋白进行了初步纯化，为进一步比较两种短肽的抗NDV 活性，筛选出具高效抗NDV活性的肽及制备抗NDV的生物肽药物研究奠定了 基础。 关键词：新城疫病毒；九肽；突变体；克隆；融和表达； Ⅱ Clonging Clonging and Prokaryotic Expression of the Gene of the Novel Pe ptide that Inhi bit the Propagation of Newcastle Disease Virus and its Mutation ABSTRACT oBJECTIVE：To olone and prokaryotio expression and identifioation the nonapeptide that inhibit the propagation of Ne、Ⅳo嬲Uc Disease Vhus(NDV)and its mutation． M匝THoDS：Aooording to the sequenoe of nonapeptide whioh reporteA by referenoe，designed the 2 rzpeats of nonapoptide’8 gene．The mutant Wn．oonsmaotcd aooording to the reference，replaoe the 6血oodon for iy．with Tyr．Synthesized the 2 repeats of nonapcptides gene(Nonap