慢病毒介导人CCL21基因转染对胰腺癌细胞PANC1作用的实验研究-临床医学;外科学专业毕业论文.docx

济南大学砸}二学{々论之目 济南大学砸}二学{々论之 目 录 中文摘要 Ⅲ 英文摘要 Ⅵ 主要符号表 X 弓I 言 l 第一部分人CCL21基因克隆及其序列分析 3 前言翮舌 ”” ·3’J 材料和方法 5 结果 13 讨论 ·· ·17 结论 ·· ·20 参考文献 21 第二部分CCL21重组慢病毒载体的构建及序列分析 23 前言刖舀 ·“ “ ‘ZJ23 材料和方法 24 结果 ．．·29 讨论 31 结论 ··· 34 参考文献 35 第三部分Real．time PCR筛选CCR7高表达的胰腺癌细胞株 36 前一言刖舌 ”·” “ ”Jb36 材料和方法 37 结果 41 讨论 · ··43 结论 45 参考文献 46 幔《毒令导k 幔《毒令导k rrL2l甚翼铸染对暖隙埤细跑rPV 1)作Ffl的实验研究 第四部分CCL21重组慢病毒载体转染PANC一1细胞株及对其生物学行为的作用 48 前f。占日U舌 4848 材料和方法 50 结果 ” ·57 讨论 ““ ”61 结论 ” ·63 参考文献 64 第五部分Real．time PCR芯片检测CCL21基因细胞转染后相关基因的变化 66 前言日U舌 66b6 材料和方法 68 结果 ·· ·75 讨论 79 结论 83 参考文献 84 文献综述 86 攻读学位期间取得的成果 93 致谢 95 H 济南上学硕卜学p论之慢病毒介导人CCL21基因转染 济南上学硕卜学p论之 慢病毒介导人CCL21基因转染 对胰腺癌细胞(PANe-1)作用的实验研究 专业：外科学 研究生：崔凯 指导教师：李胜研究员 摘要 胰腺癌(pancreas cancer)是恶性程度较高的肿瘤之一，其发病率呈上升趋势。大多 数胰腺癌患者出现症状就诊时已属中晚期，即使手术治疗，预后亦较差，且其具有周 围血管浸润和嗜神经生长特性，早期诊断率较低，易于转移，其分化程度和淋巴转移 直接影响患者的预后，因此，对于深入研究胰腺癌的治疗意义重大。 趋化因子(chemokine)是一类结构同源、功能相似的细胞因子超家族，其作用 是启动并调节特异性细胞在体内迁移与定位，其中部分细胞正是机体抗肿瘤免疫的效 应细胞。次级淋巴组织趋化因子(secondary lymphoid tissue chemokine，SLC)属于CC／l! 族趋化因子，fl[JCCL21，通过趋化、介导免疫细胞产生抗肿瘤免疫应答，发挥抗肿瘤 免疫效应，但其又具有双向效应，可促进肿瘤细胞分泌蛋白水解酶，加快肿瘤细胞的 侵袭转移，导致肿瘤进展。 慢病毒(Lentivirus)载体是一类重组反转录病毒载体，由慢病毒经过改造而成，具 有更高的生物安全性和外源基因的表达效率，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染 能力，并可以在体内较稳定的表达，其感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会 利用宿主细胞产生新的病毒颗粒，安全性好。慢病毒载体是目前基因治疗中研究较多 的载体。 目 的 本课题研究通过克隆人的CCL21基因，构建pEASY-T1 simple—CCL21质粒，经 序列测定后进一步构建人CCL21基因慢病毒表达载体，稳定转染Real．time PCR筛选 Ill 慢瞒毒令导J、rrL2l幕翼转瓷z1．辏臻廊纲咆rPANt 慢瞒毒令导J、rrL2l幕翼转瓷z1．辏臻廊纲咆rPANt 1)作E目的实验研究 出的高表达CCR7的胰腺癌细胞株PANC．1，观察细胞生物学行为的变化，进一步通 过PCR基因芯片检测目的基因转染后细胞内信号通路中某些基因的变化，探讨人 CCL21基因转染对胰腺癌的作用。 方法 1．利用基因克隆技术克隆出人CCL21基因，连接在pEASY-T1 simple cloning vector上，构建成pEASY-T1 simple—CCL21质粒，再进行序列测定； 2．利用基因蘑组技术将人CCL21基因连接慢病毒载体PcDH删‘MCS埘1啪pGFP，进 行病毒包装，滴度测定后浓缩纯化； 3．利用Real-time PCR从培养的5种人胰腺癌细胞株(AsPC．1，BxPC．3，CFPAC。l， PANC．1，SWl990)中筛选出高表达CCR7的细胞株； 4．通过慢病毒转染预实验确定MOI，进行人CCL21重组慢病毒载体转染PANC．1 细胞株，分为阳性实验组、阴性对照组、空白对照组，利用PCR、Westernblot技术 进行验证，观察转染后PANC．1细胞株生物学行为的变化。 5．采用RT2profiler诩PCR芯片检测与肿瘤侵袭转移、血管生成、凋亡、黏附、细 胞周期、信号转导等有关因子的84个基因，深入分析基因变化趋势，Western blot验 证，探讨人CCL21基因对PANC．1细胞株侵袭转移的作用。 实验结果均采用