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实验三 酶的固定化 一、实验基本原理 把糖化酶悬浮在海藻酸钠溶液中。滴入氯化钙溶液。形成海藻酸钠凝胶小球。酶包埋在凝胶的小孔中,制成固定化酶。 葡萄糖淀粉酶(糖化酶)活性测定原理:在一定条件下能水解淀粉生成葡萄糖。葡萄糖的醛基被弱氧化剂次碘酸钠氧化、过量的碘用硫代硫酸钠滴定。从碘的减少量计算葡萄糖的量,从而计算算酶活力。 二、实验材料、仪器与试剂 (一)实验材料与仪器 干燥箱;电子天平;注射器;碘量瓶;磁力搅拌器;pH计;恒温水浴锅等。 (二)主要试剂 糖化酶;3%海藻酸钠溶液;2%氯化钙溶液。 2%可溶性淀粉液; pH4.6、0.1mol/L醋酸缓冲液; 0.1mol/L碘液; 0.1mol/L氢氧化钠溶液; 1mol/L硫酸溶液; 0.05 mol/L硫代硫酸钠溶液; 0.5%淀粉指示剂。 三、实验内容 (一)固定化酶的制备 1、将海藻酸钠溶液于45℃水浴保温。 2、取糖化酶2g,悬浮在10ml海藻酸钠溶液中混合均匀。 3、用注射器吸取上述悬浮液,逐滴滴入到50 ml氯化钙溶液中,浸泡20 min左右。 4、滤出凝胶珠用蒸馏水洗涤几次,除去凝胶珠表面的酶,得到固定化酶。置于4℃冰箱中冷藏备用。 (二)糖化酶活力测定 1、吸取2%可溶性淀粉10ml,加入pH4.6、0.1mol/L醋酸缓冲液5ml,混匀后于40℃水浴预热10min。 2、加入酶液1ml(空白实验以煮沸失活的酶液代替正常酶液),于40℃,反应10min。反应结束时,于沸水浴中煮10min,以终止反应。 3、吸取上述反应液5ml于碘量瓶中,加入0.1mol/L碘液及0.1mol/L氢氧化钠溶液各5ml,摇匀,于室温下在暗处放置15min,加入2ml硫酸酸化。 4、以0.5%可溶性淀粉为指示剂,用0.05 mol/L硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色消失为终点。记录硫代硫酸钠溶液消耗的毫升数(A),以及空白实验消耗的硫代硫酸钠溶液毫升数(B)。 四、实验数据基本要求 * (一)酶活力计算 在上述条件下,每小时催化淀粉水解生成1mg葡萄糖的 酶量定义为一个酶活力单位。 (二)固定化酶活力回收率计算 活力回收率= (三)固定化酶比活力计算 固定化酶总活力 游离酶总活力 *
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