实验三酶的固定化.pptVIP

实验三 酶的固定化 一、实验基本原理 把糖化酶悬浮在海藻酸钠溶液中。滴入氯化钙溶液。形成海藻酸钠凝胶小球。酶包埋在凝胶的小孔中，制成固定化酶。 葡萄糖淀粉酶（糖化酶）活性测定原理：在一定条件下能水解淀粉生成葡萄糖。葡萄糖的醛基被弱氧化剂次碘酸钠氧化、过量的碘用硫代硫酸钠滴定。从碘的减少量计算葡萄糖的量，从而计算算酶活力。 二、实验材料、仪器与试剂 （一）实验材料与仪器 干燥箱；电子天平；注射器；碘量瓶；磁力搅拌器；pH计；恒温水浴锅等。 （二）主要试剂 糖化酶；3%海藻酸钠溶液；2%氯化钙溶液。 2％可溶性淀粉液； pH4.6、0.1mol／L醋酸缓冲液； 0.1mol／L碘液； 0.1mol／L氢氧化钠溶液； 1mol／L硫酸溶液； 0.05 mol／L硫代硫酸钠溶液； 0.5％淀粉指示剂。 三、实验内容 （一）固定化酶的制备 1、将海藻酸钠溶液于45℃水浴保温。 2、取糖化酶2g，悬浮在10ml海藻酸钠溶液中混合均匀。 3、用注射器吸取上述悬浮液，逐滴滴入到50 ml氯化钙溶液中，浸泡20 min左右。 4、滤出凝胶珠用蒸馏水洗涤几次，除去凝胶珠表面的酶，得到固定化酶。置于4℃冰箱中冷藏备用。 （二）糖化酶活力测定 1、吸取2%可溶性淀粉10ml，加入pH4.6、0.1mol／L醋酸缓冲液5ml，混匀后于40℃水浴预热10min。 2、加入酶液1ml（空白实验以煮沸失活的酶液代替正常酶液），于40℃，反应10min。反应结束时，于沸水浴中煮10min，以终止反应。 3、吸取上述反应液5ml于碘量瓶中，加入0.1mol／L碘液及0.1mol／L氢氧化钠溶液各5ml，摇匀，于室温下在暗处放置15min，加入2ml硫酸酸化。 4、以0.5％可溶性淀粉为指示剂，用0.05 mol／L硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色消失为终点。记录硫代硫酸钠溶液消耗的毫升数（A），以及空白实验消耗的硫代硫酸钠溶液毫升数（B）。 四、实验数据基本要求 * （一）酶活力计算 在上述条件下，每小时催化淀粉水解生成1mg葡萄糖的 酶量定义为一个酶活力单位。 （二）固定化酶活力回收率计算 活力回收率= （三）固定化酶比活力计算 固定化酶总活力 游离酶总活力 *