实验五六 大肠杆菌感受态的制备、重组DNA的转化和抗药性筛选.ppt

大肠杆菌感受态的制备、重组DNA的转化和抗药性筛选 朱文博 中山医学院 基因克隆(又名分子克隆，DNA克隆)(gene cloning) 通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。 基因克隆的核心----体外重组(Recombination) : 人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。  重组DNA技术(又名基因工程) (recombinant DNA technology ) 定义： 实现基因克隆所采用的方法及相关的工作统称为重组DNA技术，又称基因工程。 广义的基因工程指按人们意愿设计，通过改造基因或基因组而改变生物的遗传特性。如用重组DNA技术，将外源基因转入大肠杆菌中表达，使大肠杆菌能够生产人所需要的产品；将外源基因转入动物，构建具有新遗传特性的转基因动物；用基因敲除手段，获得有遗传缺陷的动物等。 1 感受态(competent) 宿主细胞处于容易吸收外源性DNA的状态，处于感受态的细胞称为感受态细胞. 1.1 制备感受态细胞的原理 正常细胞都有细胞膜（细菌还有细胞壁）作屏障，对外源分子选择性接受。在实验中通过一定的理化条件使细胞通透性增大，处于感受态。 1.2 制备感受态细胞和转化的常用方法 2 CaCl2法制备感受态细胞和转化的原理 重组DNA的抗药性筛选 基因克隆基本步骤 （1）分（分离目的基因）：从生物体复杂的基因组中分离出所需要的DNA片段，即目的基因 （2）切（切割目的基因和基因载体）：用限制性内切核酸酶切割目的基因和基因载体，以利于将两者连接形成重组体。 （3）接（连接目的基因和基因载体）：在体外将目的基因连接到能够自我复制的载体DNA分子上，形成重组DNA（重组体）。 1 目的基因的获取 1.1 化学合成法：已知序列 1.2 基因组DNA文库： 将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。用于研究基因在基因组中的情况。 1.3 cDNA文库：以组织细胞中的mRNA为模板，经反转录等反应合成双链cDNA ，各cDNA分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。仅包含正在表达的基因，总量少，易筛选。 1.4 聚合酶链反应(PCR):广泛采用 2 克隆载体的选择和构建 基因工程的载体应具有一些基本的性质： 1）在宿主细胞中有独立的复制和表达的能力 2）分子量尽可能小 3）载体分子中最好具有两个以上的容易检测的遗传标记 4）载体本身最好具有尽可能多的限制酶单一切点。 DNA克隆常用的载体有：质粒载体(plasmid)，噬菌体载体(phage)、柯斯质粒载体(cosimid)、单链DNA噬菌体载体(ssDNA phage)、噬粒载体(phagemid)及酵母人工染色体(YAC)等。 3 外源基因与载体的连接 ①粘性末端连接： ②平头末端连接： ③同聚寡核苷酸末端连接 ④人工接头分子连接： 四 重组DNA导入宿主细胞 ①转化(transformation)或转染(transfection)：通过特殊的处理方法将外源遗传物质(如质粒DNA等)导入原核或真核细胞，引起遗传性状变化的现象。 ②感染(infection)：病毒类侵染宿主菌的过程称为感染，一般转导的效率比转化高。 五 重组体的筛选 (1)直接筛选： ①抗药性标志选择 ②标志补救:蓝白斑筛选(α互补原理筛选重组体) ③分子杂交：广泛用于筛选含有特异DNA顺序的克隆。方法是将菌落或噬菌斑“印迹”到硝酸纤维膜等支持物上，变性后固定在原位，然后与标记的核酸探针进行杂交。阳性点的位置就是所需要的克隆。 (2)免疫学方法： 如果重组克隆能在宿主菌中表达，就可以用特异的蛋白质抗体为探针，进行原位杂交，选择特异的克隆。 * * 基因克隆示意图 分、切 接 转 筛 大肠杆菌感受态的制备及重组体转化 1、CaCl2转化程序法：传统方法,转化效率能达到5?106-2?107转化子/?g质粒DNA,简单、快速、重复性好、菌株适用范围广。 2、电穿孔转化法； 3、脂质体(liposome)法； 4、胞核的显微注射法(microinjection)； 5、磷酸钙介导的转染； 6、聚乙二醇介导的原生质体转化法。 1. 一般受体菌对重组DNA分子的摄取能力很低，难以转化成功。当细菌处于冰冷（0℃）0.05-0.1M的 CaCl2低渗溶液中，菌体的细胞膨