DNA测序 化学降解法.ppt

序列测定 ;脱氧 核糖; ;成熟的测序技术始于世纪年代中期。 ●年 和报道了通过化学降解测定序列的方法。 ●同一时期, 发明了双脱氧链终止法 ● 世纪年代初出现的荧光自动测序技术将测序带入自动化测序的时代。 这些技术统称为第一代测序技术。;第二代测序技术;三种第二代测序技术对比;第三代测序技术; 化学降解法;;该反应的关键在于使的种核苷酸中，只有种发生特异性的化学切割反应： 碱基的特异性修饰； 修饰的碱基从核糖环上转移； 失去碱基的糖环部位发生链断裂。 专门用来对核苷酸作化学修饰，并打断磷酸二酯键的化学试剂有硫酸二甲酯（)和肼()、哌啶甲酸等。 ;哌啶甲酸(℃)在修饰位点两端使的糖磷酸链断裂 ;?硫酸二甲酯[ ， ，（）]： 一种碱性化学试剂，可以使链上的腺嘌呤的和鸟嘌呤的７甲基化，但是鸟嘌呤的７甲基化速度比腺嘌呤的甲基???速度要快倍，并且在中性环境中，主要作用于鸟嘌呤，使之甲基化，导致糖苷键断裂。;化学降解反应体系 反应体系 碱基修饰试剂 碱基修饰反应 主链断裂试剂 断裂点 硫酸二甲酯 鸟嘌呤甲基化 六氢吡啶 甲酸 脱嘌呤作用 六氢吡啶 和 肼 嘧啶开环 六氢吡啶 和 肼（加盐） 胞嘧啶开环 六氢吡啶 ;;;;;′— — ′;在化学修饰反应过程中，通过控制反应温度和反应时间，只有一小部分碱基被修饰(而不是全部被修饰)，随后进行的断裂反应也是定量反应。因此，链并不是在所有可被修饰的碱基位点断裂，而是随机断裂。在个反应中，产生套带相同标记末端、长短不一的寡聚核苷酸片段。只有带标记末端的片段可被识别，没有标记末端的片段可以忽略不计。;、;电泳和读谱;电泳检测;步骤１：毛细管灌胶;步骤２：样品盘移动;步骤３：电进样及电泳;步骤４：荧光激发及检测;化学法读序的方法;聚丙烯酰胺凝胶电泳将链按长短分开,根据放射自显影显示区带，直接读出的核苷酸序列。;;序列测定的应用;化学降解法的测序长度约 ;缺点：;谢谢大家!