DNA的测序方法、原理及其应用.ppt

的测序方法、原理及其应用 ;一、序列测定概述及其发展; 年，和等人第一次完成胰岛素个 氨基酸的序列测定，这在当时来说是一件了不起的大事。 年代后期，和等人又建立了核酸序 列测定的方法，双脱氧末端终止法和 化学裂解法将核酸序列测定技术推进到“直读”阶段， 使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易，这样 人们可以通过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序 列。;二、测序的常用方法; ）双脱氧链终止法测序( ) 基本原理： 通过合成与单链互补的多核苷酸链，由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的分子，从而来读取待测分子的顺序。;用于终止反应的双脱氧核苷酸： 将’ ，’ –双脱氧核苷酸（）参入到新合成的链中，由于参入的缺乏’ –羟基，因此不能与下一位核苷酸反应形成磷酸二酯键，合成反应将中止。;O;O;;） 化学降解法测序 基本原理： ① 用放射性核素标记待测一侧末端 ② 将标记分为、、、 个反应体系 ③ 用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂片段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为放射线标记的末端，另一端为不同大小的片段的混合物 ④ 电泳分离，放射自显影得到互相错落的梯形图谱，即可读出序列;;表特异断裂种脱氧核苷酸的方法;在种反应体系中，化学试剂特异地断裂的机制是： 反应硫酸二甲酯（）使甲基化，其后断开了间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。 反应（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，削弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。 反应肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。 反应在存在时，只有才能与肼发生反应，随后，被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。;★ 碱基特异性修饰及裂解;;） 自动化测序;三、种方法的比较;法只需简单化学试剂。所测序列来自原分子而不是酶促合成反应所产生的拷贝，因此利用化学法可以对合成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲基化等修饰的情况。但所能测定的长度要比法短一些，它对放射性标记末端 个核苷酸以内的序列效果最佳。 法虽需要单链模板和特异寡核苷酸，并需获得大肠杆菌 聚合酶 片段的高质量酶制剂，而随着 噬菌体和噬菌粒载体的发展，也由于现成的合成引物容易获得及测序反应日期完善，双脱氧链终止法如今远比法应用得广泛。 由于法既简便又快速，目前大多数测序策略都是为法而设计的。 ; 自动测序与手工测序的不同点;四、序列测定的应用;*;西南大学生物技术专业 基因工程;氨基酸序列同源性分析;碱基序列同源性;分子进化树分析亲缘性关系;西南大学生物技术专业 基因工程;谢谢！