环状沉淀实验报告.docxVIP

环状沉淀实验报告 　　实验三沉淀反应　　可溶性抗原如血清，毒素、细菌浸出液等和相应抗体相遇，当二者比例适当，并有电解质参与时，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应(precipitation)。参与沉淀反应的抗原称为沉淀原，抗体称为沉淀素。由于沉淀原多为可溶性物质，单位体积内所含的抗原量较多，与抗体结合的总面积大，为求得抗原与抗体的适当比例，操作时稀释抗原而不是稀释抗体，一般以出现沉淀现象的抗原最高稀释度作为沉淀反应效价。　　沉淀反应是临床上常用的血清学试验之一。它的种类很多，有环状沉淀、琼脂扩散、免疫电泳等。利用可溶性抗原与相应抗体在半固体琼脂内进行扩散，当抗原与抗体相对应，二者比例适合时，就出现白色沉淀物。本试验可在试管内、平皿中以及玻片上的琼脂内进行操作。琼脂扩散试验可分为单向琼脂扩散试验与双向琼脂扩散试验等。　　一、单向琼脂扩散试验　　【原理】　　是单向免疫扩散(singleimmunodiffusion)试验中的一种定量试验。将一定量的抗体混合于琼脂内，倾注于玻璃板上，凝固后，在琼脂层中打孔，再将抗原加入孔中。孔中抗原向四周扩散，在抗原与抗体比例合适处，呈现白色沉淀环。沉淀环的直径大小与抗原的浓度成正比。如事先用不同浓度的标准抗原制成标准曲线，则未知标本中的抗原含量可从标准曲线中求出。本试验主要用于检测血清中IgG、IgM、IgA和补体C3等的含量。　　【材料】　　1．%盐水琼脂(生理盐水配制，琼脂含量%)。　　2．人IgG诊断血清。　　3．待检标本人血清。　　4．全国统一人血清免疫球蛋白参考血清，系冻干正常人混合血清。　　5．载玻片、微量加液器、打孔器(直径3mm)、注射针头、两脚规、直尺、半对数坐标纸等。　　【方法】　　1．将适宜稀释度的诊断血清与预先溶化的%琼脂在56℃水浴中混匀，每　　块载玻片浇注3ml，制成免疫琼脂板。　　2．用打孔器在免疫琼脂板上打孔，孔间距为～，挑出孔内琼脂。　　3．稀释参考血清每支干燥血清中加入蒸馏水，待完全溶解后，用～倍比稀释成1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160等5种浓度。　　4．加样用微量加液器取10μl各种不同浓度的参考血清，准确地加到琼脂板的各孔中，每种浓度加2个孔，用以制作标准曲线。测待检血清时，血清用PBS作1∶40稀释，每孔加10μl，每份标本加2个孔。　　5．加样的琼脂板置湿盒内，经37℃24h后取出，测各孔沉淀环直径(图1-1)。　　【结果】　　1．取出琼脂板，即可见清晰的乳白色沉淀环。　　2．标准曲线的绘制以各种浓度标准抗原的沉淀环直径为横坐标，相应孔中IgG含量为纵坐标，在半对数纸上画出标准曲线。根据待检血清沉淀环的直径，查标准曲线，将查得的IgG含量乘以标本的稀释倍数，即为血清中IgG含量(图1-2)。　　图1-1单向琼脂扩散试验示意图　　【注意事项】　　1．制备免疫琼脂板时要掌握好温度。温度过高会破坏抗体活性；温度低于42℃则琼脂很快凝固，不能制板。　　2．应从低浓度到高浓度的顺序加样，以免出现误差。　　3　　．沉淀环的直径以毫米为单位测量。　　沉淀环直径图1-2单向扩散标准曲线示意图　　一、ABO血型的测定　　将含有抗原的透明浸出液重叠于含有抗体的免疫血清上，在两液交界处发生环状的白色沉淀物，即称为环状沉淀反应。　　炭疽环状沉淀反应又称为阿斯可里氏反应。具体操作方法如图实9-1所示。　　沉淀原的制备　　1．热浸法取被检材料1～3g，在乳钵内研碎，然后加5～10倍生理盐水混合，用移液管吸至试管内，置于水浴锅中煮沸15～30分钟，用中性石棉过滤，获得的透明滤液，　　可再过滤—次。　　2．冷浸法用以检查怀疑为炭疽病畜的皮革和兽毛等材料，操作前，先将其高压灭菌30分钟，以保证检查者的安全。然后取被检材料1g，浸于5～10倍的％石炭酸生理盐水中，在室温下或普通冰箱浸泡14～20小时，用中性石棉过滤，透明的滤液即为沉淀原。　　方法与判定　　用毛细吸管吸取少量炭疽沉淀素血清，沿管壁徐徐注入沉淀反应管内，通常达管的1/3高处，再用另一支毛细吸管吸取制备的沉淀原，沿管壁缓慢注入，使之重叠于炭疽沉淀素血　　清上面，达到试管的2/3高处。直立静置，在1～5　　分钟内，两液面交界处若出现清晰、整齐　　的环状白轮，则为阳性。　　为了验证反应的正确性，检验时可做　　如下三种对照试验；　　1．炭疽沉淀素血清加标准炭疽沉淀　　原，应为阳性；　　2．标准炭疽沉淀原加健康马血清，应　　为阴性；　　3．生理盐水加炭疽沉淀素血清，应为　　阴性。　　二、琼脂扩散沉淀反应　　抗原、抗体在含有电解质的琼脂凝胶基质中可以向四周自由扩散，如果二者是相应的具有特异性，则在—定部位相遇，并发生反