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第9章 转基因动物与动物生物反应器 一 转基因动物的制备方法 二 转基因动物的应用 三 乳腺生物反应器 四 基因打靶 转基因动物 基因工程技术 胚胎工程技术 转基因动物（transgenic animal）是指借助基因工程技术将外源基因导入受体动物染色体内，外源基因与动物基因整合后随细胞的分裂而扩增，在体内表达并能稳定地遗传给后代的动物。 转基因动物的命名 原代转基因动物:founder G0 G1 G2 拟人化命名 伦理问题 人类在认识自然改造自然上的巨大进步 潜在的危害 1982年,Palmiter生产超级小鼠世界上第一只转基因动物:转入了生长激素基因的巨鼠（supermouse） 哺乳动物转基因技术的主要环节 1 目标基因克隆和体外重组 2 外源基因的导入 3 外源DNA整合、转录及表达的分子检测 4 转基因动物品系或品种的建立 哺乳动物生殖生理 一 转基因哺乳动物的制备方法 显微注射法 逆转录病毒载体感染 精子载体介导法 胚胎干细胞介导法 体细胞克隆技术 精原干细胞介导法 YAC介导的基因转移??? 1 显微注射法 Microinjection into the Pronucleus of a Bovine Zygote a、转移率较高、整合效率达20%； b、外源基因长度可达数百Kb； c、可得纯系动物； d、周期相对较短。 a、设备昂贵、操作复杂； b、随机整合、首尾相连的多拷贝； c、转基因效率较低，约0.5%-3%; d、常造成插入位点附近宿主DNA大片段缺失、重组等突变，出现动物严重生理缺陷。 2．逆转录病毒载体感染法 原理：当逆转录病毒的RNA 进入细胞后，逆转录成DNA ，依靠逆转录病毒的整合酶及其末端特异的核苷酸序列，DNA前病毒可整合到染色体上，从而将其所携带的外源基因插入到染色体上。 逆转录病毒载体 逆转录病毒感染法特点 优点：在各种转基因方法中，逆转录病毒感染法的转基因效率是最高的，且为单拷贝随机整合。 缺点：逆转录病毒载体在设计时虽然缺失了病毒的复制功能序列，但是复制大量载体DNA所需的辅助病毒基因组内有可能与目的基因一起整合到同一细胞核中，就可能大量复制病毒，造成严重的污染，故不安全。此外，逆转录病毒载体容量有限，只能转移小片段DNA（≦10kb），而且逆转录病毒长末端重复的甲基化状态常使转基因的表达缺失。 3 精子载体法 1989 年, Lavitrano等将质粒与小鼠的附睾精子，在等渗溶液中共育30 min 后进行体外受精和移植，产生转基因阳性小鼠并能遗传给后代。 Rottman 等对上述精子载体法进行了改进，其将外源DNA 用脂质体包埋，再与鸡精子共同孵育，然后人工受精取得成功。 Anthony等尝试了一种新的方法，预先将小鼠的精子进行破膜处理，再与外源基因共孵育1 min ，然后将精子头部显微注射入M Ⅱ期的小鼠卵母细胞，获得成功。该项研究揭示，精子膜破损后外源DNA 穿过外膜吸附于内膜,更有利于转基因动物的产生。 精子与外源DNA结合的机理 Smdrdora(1998) 的研究结果表明。只有附睾精子和经洗涤去精清的精子才能有效地携带外源DNA，这说明精浆中某种因子强烈抑制外源DNA的结合。这些因子可能直接作用于DNA分子，也可能竞争结合在精子表面的结合部位而间接起作用。 促进DNA与动物精子结合的方法 1 共孵育法 2 电穿孔法 3 脂质体法 精子载体法？？？？ 别人无法重复 4、胚胎干细胞法 与传统育种方法相比较，ES细胞在生产转基因动物方面表现其独特的优势： （1）打破了物种的界限，突破了亲缘关系的限制，加快了动物群体遗传变异程度； （2）可以进行定向变异和育种，利用同源重组技术对ES细胞进行遗传操作，通过细胞核移植生产遗传修饰性动物，有可能创造新的物种； （3）利用ES细胞技术，可在细胞水平对胚胎进行早期选择，这样可以提高选择的准确性，缩短育种时间。近年来的研究表明，利用ES细胞生产转基因动物在动物生产中发挥着极为重要的作用。 基因打靶 5 体细胞克隆转基因技术平台 Cloned sheep has human gene Korea： Production of transgenic cloned pigs transgenic cloned pigs with the green fluorescent protein(GFP) on June 8, 2003. 导入人乳铁蛋白转基因的克隆奶牛2005年初在唐山降生 6 精原干细胞介导法 generation of transgenic rats Which ge