肠炎沙门菌肽脯氨酰顺反异构酶SlyD的基因敲除表达及.pdf

微生物学报 Acta Microbiologica Sinica 2016, 56(8): 1282-1290 /actamicrocn DOI: 10.13343/ki.wsxb Research Paper 研究报告 肠炎沙门菌肽脯氨酰顺反异构酶SlyD的基因敲除、表达及酶 学特征 * 郭荣显，朱姗姗，焦扬，安树敏，薛颖，费晓，耿士忠，潘志明，焦新安 扬州大学，江苏省人兽共患病学重点实验室/ 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009 摘要： 【目的】以肠炎沙门菌肽脯氨酰顺反异构酶SlyD为对象，构建基因缺失株及表达纯化该蛋白，为 研究其在肠炎沙门菌致病性与应激等方面的作用奠定基础。【方法】参考GenBank登录的肠炎沙门菌基 因组序列设计用于slyD基因敲除及原核表达的特异引物，运用自杀质粒介导的同源重组技术对肠炎沙门 菌C50041 slyD基因进行敲除，构建C50041ΔslyD缺失株；原核表达SlyD蛋白，通过α-糜蛋白酶耦联法对 其PPIase活性进行测定；利用生物信息学相关软件，分析SlyD蛋白的氨基酸序列及功能域。 【结果】 PCR鉴定与测序结果证明成功构建了肠炎沙门菌C50041ΔslyD缺失株，其生长特性与野生株基本一致； SDS及PPIase活性分析表明，获得了具有生物活性的可溶性SlyD蛋白；生物信息学分析显示 SlyD蛋白由FKBP样肽脯氨酰顺反异构酶结构域、分子伴侣功能域和金属结合区域3个功能区域组成。 【结论】成功获得了肠炎沙门菌C50041ΔslyD缺失株和具有PPIase活性的重组SlyD蛋白。 关键词：肠炎沙门菌, SlyD蛋白, 基因敲除, 肽脯氨酰顺反异构酶 肠炎沙门菌(Salmonella enterica serovar 关的调控机制也已成为新的研究热点。 enteritidis)是一种重要的人兽共患病原菌，在世界 一般而言，生物体内新生肽链成熟为功能蛋 范围内广泛流行。食用被污染的禽肉制品及蛋制 白需要折叠酶和分子伴侣的辅助才能完成。肽脯 品是人类感染肠炎沙门菌的主要来源，一般导致 氨酰顺反异构酶(Peptidal-prolyl cis-trans isomerase, [1] 胃肠道局部疾病，引发呕吐和腹泻等症状 。肠 PPIase)和二硫键异构酶(Protein disulfide isomerase, 炎沙门菌的致病机理及防控措施愈来愈受到人们 PDI)催化蛋白质折叠过程的限速步骤，是目前已 [2] 关注，与细菌致病性、应激及对外界环境感应相 被确定的两类折叠酶 。SlyD (sensitive to lysis 基金项目：国家自然科学基金重点国际合作项目(31320103907) ；国家公益性行业(农业)科研专项(201403054) ；江苏省优势学科 经费资助；江苏省研究生培养创新工程项目(KYLX15_1384)