抗血小板胶原受体糖蛋白Ⅵ单克隆抗体的制备和功能研究-内科血液学专业毕业论文.docxVIP

抗血小板胶原受体糖蛋白vl单克隆抗体的制备和功能研究 抗血小板胶原受体糖蛋白vl单克隆抗体的制备和功能研究 中文摘型 摘 要 ff『L栓性疾病严重威胁人类健康。动脉血栓形成常导致相应脏器功能衰竭。研 究血栓形成机制及探索抗血栓治疗方法是重要的研究方向。在动脉血栓形成中血 小板发挥重要作用，血小板通过其表面膜糖蛋白(如GPIb—IX—V，GPlIb．Ilia，GPVl。 GPIa—IIa)与损伤后暴露的血管内皮下胶原发生粘附，继而在损伤部位形成血小板 凝块、促进凝血发生、导致血栓形成。由此可见，在血栓形成的起始阶段，m小 板与胶原的有效粘附是不可缺少的先决条件，抑制血小板粘附功能将产生显著的 抗血栓功效。新型抗血栓药物Abciximab阻断GPIIb—lIIa与纤维蛋白原结合而发挥 抗血栓作用，但也存在引起严重出血的潜在危险。近年来，抗粘附治疗作为新的 抗血栓手段已引起广泛关注，通过抑制GPIb—vWF一胶原轴和GPVI／GPIa，iIa一胶 原轴阻断血小板与胶原的粘附，即在早期阶段阻止血小板的粘附、活化，可能起 到更好的抗血栓形成作用，并可减少出血的危险性。在高剪切力条件下，血小板 与胶原粘附依赖胶原受体GPVI、GPIa．IIa，和间接胶原受体GPIb．IX—V。而血小板 粘附后的活化过程主要由GPVI所介导。GPVI是血小板重要的胶原受体，生理状 态下，GPVI与FcR Y链形成异源二聚体，共同发挥信号转导作用。GPVl基因剔 除或抑制GP,VI功能均可特异性地阻止血小板与胶原的粘附和聚集，对正常止血功 能影响小。因而，GPVI成为抗粘附及抗血栓治疗的新靶点，GPVI功能抑制剂有 望成为新的抗血栓药物。 基于上述GPVI在血栓形成中的重要性，我们开展了GPVI功能研究及抗GPVI 单克隆抗体的研制工作，以探索抗血栓治疗的新途径。采用基因重组技术克隆了 GPVI胞外区基因片断，并在原核细胞中成功表达。以重组蛋白为抗原免疫小鼠， 采用细胞融合和单克隆筛选技术制备了抗GPVI单克隆抗体；同时利用分子生物学 技术克隆了该抗体的重链可变区和轻链可变区基因片断，经连接子连接后制备了 单链抗体，并在原核细胞中表达。利用血小板聚集试验和流式小室技术观察了该 单抗和单链抗体对胶原诱导的血小板聚集，以及对血小板与胶原表面粘附的抑制 情况。 一、以含GPVI全长cDNA质粒pBluescript KS(一)一GPVI为模板，采用PCR方 法扩增GPVI胞外区片断cDNA序列，构建了表达载体pET-20b(+)～GPVI，转化 大肠杆菌BL2l(DE3)plysS，经IPTG诱导表达目的蛋白。12％SDS—PAGE分析 抗血小扳胶原受体糖蛋白vI单克隆抗体的制备和功能研究 抗血小扳胶原受体糖蛋白vI单克隆抗体的制备和功能研究 中文摘要 显示，重组GPVI(rGPVI)相对分子量约32kDa，表达量占菌体总蛋白的14％，且 主要以包涵体形式存在。经Ni—NTAResin纯化后可获得高纯度的rGPVI。Western b101分析证明rGPVI可被抗Penta—His抗体和兔抗GPVI抗体所识别。rGPVI经复 性后仍具有良好的生物学活性，胶原结合试验表明rGPVl具有与I型胶原结合功 能，呈剂量依赖性。另外，rGPVI与I型纤维状胶原温育后，可抑制该胶原诱导的 血小板聚集，抑制率可达77-8％。提示rGPVI可竞争性抑制胶原与血小板的相互 作用。 二、以rGPVI为抗原免疫小鼠，采用本室建立的方法进行脾细胞融合、HAT 选择培养及单克隆筛选。初步筛选到9个阳性克隆，对其中一稳定分泌抗体的杂 交瘤细胞株，SZll8，进行了深入研究。Westemblot和流式细胞术检测发现，SZll8 可结合重组蛋白和血小板，而不与红细胞和白细胞反应。在血小板聚集试验中， 当SZIl8与PRP孵育后，则显著抑制纤维状胶原(1 ug／m1)和Convulxin(0．2nmol／L) 诱导的血小板聚集，且呈抗体剂量依赖关系；最大抑制率分别为85．9％年11 43％； 但对ADP诱导的聚集无明显影响。采用平行板流动小室法测定血小板在胶原表面 的粘附状况及特异性抗体的抗粘附效应。I型纤维状胶原或纯化的vWF包被塑料 培养皿，形成小室的底面；抗凝全血在高剪切力条件下通过胶原或vWF表面，形 成有效的衄小板粘附和血小板凝块。SZll8(50ug／m1)与抗凝全血预先温育后， 则可明显抑制在相同条件下的血小板粘附反应，对胶原粘附的最大抑制率达95．5 ％，对vWF粘附的抑制率为35．7％。观察发现，SZll8明显抑制血小扳与vWF 表面的稳定粘附，血小板多以单个形式粘附，不能形成有效的血小板凝块。 三、单链抗体保留了源抗体结合抗原的特异性，降低了鼠源抗体的免疫源性 及Fc段