用于单克隆抗体肽谱分析的一体化工作流程.pdfVIP

用于单克隆抗体肽谱分析的一体化 工作流程 应用简报 生物治疗药物和生物仿制药 作者 前言 David L. Wong 单克隆抗体 (mAb) 是制药行业中发展最快的一类药物。mAb 作为蛋白质药物， 安捷伦科技有限公司 从初始表达到最终商业化经历了一个高度复杂的过程，需要在每个步骤中对其 Santa Clara, CA, USA 进行仔细表征。在用于 mAb 表征的众多分析方法中，肽谱分析是一项至关重要 的技术，它能够实现 mAb 的一级结构确认，还可以对翻译后修饰 (PTM) （如脱 Jing Chen 1 酰氨基化、氧化和糖基化）进行鉴定和定量分析。 安捷伦科技有限公司 Madison, WI, USA 使用 LC/MS/MS 方法进行的 mAb 肽谱分析包括将纯化的 mAb 酶裂解为肽段、串 联质谱分析以及数据解析。样品前处理通常涉及多个步骤，包括变性、还原、 烷基化和酶解。手动进行肽谱分析样品前处理的过程十分繁琐，且易于受到可 扩展性和重现性不佳的影响。 此应用简报展示了一个高通量工作流程，能够同步进行样品消解和样品净化， 具有很高的重现性。分析过程中使用 Agilent AssayMAP Bravo 液体处理自动化系 统、Agilent 1290 Infinity II 液相色谱与 Agilent 6550 Q-TOF 质谱联用系统（用于灵 敏而准确的谱图采集），以及 Agilent MassHunter BioConfirm 软件（用于数据自动 分析）。 实验部分 然后将 210 µL 稀释剂 (50 mM Tris, pH 7.5) 质谱系统 加入到样品中，随后加入 5 µL 用 50 mM 配有安捷伦双喷射流离子源的 Agilent 材料 乙酸稀释的各种浓度的胰蛋白酶/LysC 6550 iFunnel Q-TOF 液质联用系统 单克隆抗体标准品 RM 8671 购自美国 混合物（酶:蛋白质 = 1:40）。 国家标准技术研究院 (NIST)。质谱级 使用 Agilent 1290 Infinity II 液相色谱 胰蛋白酶/Lys-C 酶混合物购自 Promega。 将样品密封，并在台板外于 37 °C 下 系统联用配备双喷射流 ESI 离子源的 所有其他化学品均购自 Sigma-Aldrich。 温育 2 小时。再向样品中加入 5 µL Agilent 6550 iFunnel Q-TOF 液质联用系 AssayMAP C18 小柱来自安捷伦科技 胰蛋白酶/LysC 混合物，然后将样品在 统进行 LC/MS/MS 和 LC/MS 分析。 公司。 台板外于 37 °C 下继续温育 14 小时。 使用 Agilent AdvanceBio 肽谱分析色 第二天，使用 AssayMAP 试剂转移工 谱柱 (2.1 × 150 mm, 2.7 µm) 实现液相 样品前处理