叶绿体色素含量的测定.doc

叶绿体色素含量的测定 ----分光光度法 中文摘要： 本实验利用菠菜叶作为原料用80%的丙酮提取叶绿体色素，应用分光光度计在某一特定波长下所测定的吸光度，带入公式计算出色素溶液中各色素浓度。 英文摘要： In this experiment , we used spinach leaves as raw material and used 80% of acetone to extract pigments from them ,and apply spectrophotometer at a particular wavelength to determine absorbance, then take the absorbance into the formula to calculate concentration of each pigment. 实验原理： 利用80%丙酮提取叶绿体色素，叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素最大吸收峰的波长分别是663nm、646nm和470nm。 根据分光光度计测定的吸光度值，可以计算出丙酮提取液中叶绿体色素含量。 实验目的： 掌握分光光度法对叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总浓度和类胡萝卜素总浓度测定和计算的方法。 实验器材和试剂： 1、材料：菠菜叶片 2、 用具：分光光度计、天平、研钵、漏斗、剪刀、容量瓶、烧杯、滤纸、滴管等 3、试剂：80%丙酮、石英砂和碳酸钙 实验步骤： 1.叶绿体色素的提取 取新鲜菠菜叶片0.5克,擦干,去中脉,剪碎放入研钵;加入少许石英砂和CaCO3,再加入80%丙酮3ml,研磨成匀浆,再加80%丙酮10ml,静置10分钟;用漏斗滤去残渣,用丙酮反复冲洗研钵、残渣至无色;用容量瓶定容至50ml 。 2.吸光度的测定 取光径1cm比色杯，注入上述叶绿素提取液,以80%丙酮注入另一同样的比色杯内作为空白对照,在波长663、646和470nm下测定吸光度。 3.结果计算 依据下列丙酮提取液中色素浓度计算公式,分别计算出叶绿素a、b的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的浓度。 计算公式 80%丙酮提取液中色素浓度的计算 Ca（叶绿素a）=12.2A663-2.81A646 Cb（叶绿素b）=20.13A646-5.03A663 CT（叶绿素）=Ca+Cb=17.32A646+7.18A663 Cx.c（类胡萝卜素）=(1000A470-3.27Ca-104Cb)/229 叶绿体色素含量= 实验结果： 波长 吸光度 平均值 663nm 0.819 0.816 0.817 0.817 646nm 0.414 0.424 0.421 0.420 470nm 0.828 0.846 0.847 0.840 Ca（叶绿素a）=12.2×0.817-2.81×0.420=8.7872mg/L Cb（叶绿素b）=20.13×0.420-5.03×0.817=4.3451mg/L CT（叶绿素）=Ca+Cb=13.1323mg/L Cx.c（类胡萝卜素）=(1000×0.840-3.27×8.7872-104×4.3451)/229=1.5693mg/L Ca（叶绿素a）含量=8.7872mg/L×0.05L×1/0.5g=0.8787=87.87mg/g Cb（叶绿素b）含量=4.3451mg/L×0.05L×1/0.5g=0.4345=43.45mg/g Cx.c（类胡萝卜素）含量=1.5693mg/L×0.05L×1/0.5g=0.1569=15.69mg/g 实验讨论： 1. 叶绿素a、b在蓝色区也有吸收峰，能否用这一吸收峰波长进行叶绿素的定量分析？为什么？ 定量分析的吸收峰必须要稳定，还要有强的吸收。另外，还需要考虑干扰的问题。光合色素除了叶绿素外还有类胡萝卜素，类胡萝卜素主要吸收蓝光，为了排除干扰，要选用红光。 2．为什么提取叶绿素时干材料一定要用80%的丙酮，而新鲜的材料可以用无水丙酮提取？ 在植物缺水时，植物体中的叶绿素含量会降低。干材料与新鲜材料相比水分含量较少，用无水丙酮提取不如80%丙酮下提取效果好。 叶绿素的提取除了丙酮也可以用其他的提取试剂，石油醚—乙醇、乙醚—乙醇、乙醚。 从菠菜叶中提取叶绿体色素时，用丙酮研磨法提取叶绿素的效率比石油醚．乙醇萃取法高，乙醚研磨法提取叶绿素的效果明显不如丙酮，用石油醚研磨法的效果最次，这表明最佳的提取剂为丙酮，其次为石油醚一乙醇。但用混合溶剂提取的叶绿素的纯度要比用单一溶剂提取的高，生产中可根据实际需求进行合理选用。 不同有机溶剂用直接浸提法和Arnon法从菠菜叶片中提取叶绿素的效率不同。有人做过此类提取实验，结果表明,用丙酮、乙醇浸提法提取叶绿素的效率比丙酮、乙醇Arnon法高,甲醇、乙醚浸提法提取叶绿素的效果明显不如丙