猕猴桃果实特异表达ipt基因的构建与转化体系建立的研究-果树学专业毕业论文.docxVIP

摘 摘 要 猕猴橇是霖产我国豹舅生藤本莱橱，满猕猴撬科(_ctinidiacea秽) 猕猴桃属(Actinidia)植物，娥当前世界新兴果树之～。由于其风味 独特，终生素C含蹙裹，两倍受人钠喜爱。然悉猕猴秽1种类繁多，菜 些种类的果实品质仍有需要改进之处。本研究的目的黯在利用基阂重 组技术构建猕猴桃果实特异表达ipt基因，以便利用转基因技术改进 猕猴襁暴实性状。 ipt为细胞分裂紊生物合成关键酶。细胞分裂素对植物的生瑕功 能和作艄是多方瑟的，它能诱导和促进细胞分裂，诱等蕾养物质定向 向细魏分裂素所在部位运输，还可以诱导组织分化，促进果实生长。 在生产实践中，施用苯基脲类细胞分裂素(cppu)可诱导果树单性结 实，提离座暴率，增翱糖酸跑，以及增大祭个等。在遗传转讫方灏， 迄今为止，ipt基因已用于水稻、烟草、棉花、番茄等植物的转基因研 究。然磁，在猕猴桃转基因研究中尚无类似报告。关予ipt基因在猕 猴撬采实中特异表达润题，叠分离氆猕猴桃素基因瘩渤子作为聚实 特异表达ipt基因的启动子，可以保证ipt基因在猕猴桃果实中特异 表达。猕猴桃素(Actinidin)是一静半虢氨酸爨鑫酶，只在猕猴桃巢蜜 中呈现。为此，本研究用pRA．9质粒(含有Actinidin基因启动子) 为出发质粒，构建猕猴桃果实特异表达Acfinidin．ipt嵌合基因。 另外，鳃织培莽燕实蘸基因工程的重要前提，基闲工程鼓缝织培 养及植株褥生系统为基础。许多研究表明，实生苗作为起始材料诱导 愈伤组织对植株再生效应较好。瓤璺，扶遗传学角度讲，一拣实生慧， 一种基因型，有利于扩大基因型研究范围，对于植株稃生体系建立有 一定帮助。因此开展猕猴桃实生苗组织培养体系建立的研究很有必 要。为既，本试验逐以猕猴橇耱子为莛始材瓣，磷究静予的赤霉素楚 理、消毒方法以及在不加激素隋况下六种不同培养基对猕猴桃组培实 理、消毒方法以及在不加激素隋况下六种不同培养基对猕猴桃组培实 生苗生长状况的影响，初步建立经济高效的实生苗培养体系，为猕猴 桃果实特异表达Actinidin—ipt嵌合基因转化工作奠定材料基础。 主要试验结果如下： 1．用pRA．9质粒(含有Actinidin基因启动子，1．3kb)和pUCll9 质粒(含有ipt编码基因O．7kb，Noster0．3kb)为出发质粒，通过质粒 DNA提取与酶切、酶切产物的纯化与回收、载体与片段的连接等步 骤在克隆载体pUCl 19质粒中构建猕猴桃果实特异表达Actinidin．ipt 嵌合基因，含有该嵌合基因的质粒被称作pUCll9．Actinidin．ipt。PCR 检测结果表明转化质粒pUCll9-Actinidin．ipt扩增出1．3 kb明亮片段， 而原pUCll9质粒PCR对照未扩增出113 kb条带，说明猕猴桃素启 动子已经插入到pUCll9质粒中；酶切结果表明，转化质粒 pUCll9．Actinidin．ipt经Xba I与EcoR I酶切后切出约2．3 kb的片段， 说明猕猴桃素基因启动子1．3 kb已经插入载体，并被成功的与1．0 kb 的ipt基因一同切出，而对照pUCll9经Xba I与EcoR I酶切后切出 约1．6 kb的片段，说明对照里不含有1．3 kb的猕猴桃素基因启动子， 这就充分证实猕猴桃果实特异表达Actinidin-ipt嵌合基因已经构建成 功。 2．用pRA-9质粒(含有Actinidin基因启动子，1．3kb)、pGEM-T EASY质粒(含有ipt编码基因0．72kb，)和pBll21为出发质粒，通 过质粒DNA提取与酶切、载体与片段的连接等步骤在植物表达载体 pBll21质粒中构建猕猴桃果实特异表达Actinidin．ipt嵌合基因，含有 该嵌合基因的质粒被称作pBll21．Actinidin-ipt。PCR检测结果表明转 化质粒pBll21．Actinidin-ipt可以扩增出1．3kb明亮的目的片断，分别 用Xba I与BamH I和BamH I与Sac I双酶切转化质粒，电泳结果 显示转化质粒被成功的切出了1．3kb的猕猴桃素启动予和0．72kb的ipt基因，说明植物表达载体pBll21．Actinidin—ipt已被成功构建。 显示转化质粒被成功的切出了1．3kb的猕猴桃素启动予和0．72kb的ipt 基因，说明植物表达载体pBll21．Actinidin—ipt已被成功构建。 3．以饱满完熟的美味猕猴桃种子为起始材料，初步建立了猕猴桃 实生苗组织培养体系。重点研究了附加不同浓度蔗糖的六种MS培养 基对猕猴桃组培实生苗生长状况的影响。六种MS培养基为：(1) MSq-Sucorse 109·L～；(2)MSq-Sucorse 209·L一；(3)MSq-Sucorse