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蛋白质分离纯化报告 　　高级生物与分子生物学　　实验报告　　姓名：学号：指导老师：　　实验一：重组pGEX-X载体的构建及表达　　【实验原理】：　　1.DNA连接原理：本实验将表达载体和PCR产物X进行双酶切，经琼脂糖凝胶后，割胶分离纯化的目的基因和线性化质粒，用T4DNA连接酶连接表达融合蛋白的重组质粒。　　2.大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的原理：经氯化钙处理的大肠杆菌，受短暂的热刺激后，可形成易于接受环状质粒DNA的感受态细胞。由于不同的质粒可带有不同的抗生素抗性基因，根据转化菌的耐药特性进行删选。3.裂解法小量制备质粒DNA的原理：SDS和NaOH使蛋白质和染色体DNA变性；醋酸盐使变性蛋白、染色体DNA及SDS沉淀，质粒DNA存在于上清液中；乙醇可使质粒DNA沉淀，酚、氯仿去除残留的蛋白质。　　4.重组质粒鉴定的原理：对所有的重组质粒用限制性内切酶酶切，酶切产物行凝胶电泳以鉴定质粒DNA。　　5.组质粒的诱导表达的原理：Ptac启动子受lac阻遏物所调控，该启动子需要加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTP)进行诱导。IPTP的终浓度为1mmol/L。　　6.融合蛋白的表达检测的原理：经诱导表达的重组体裂解后，经SDS鉴定。染色后明显出现目的蛋白带，而未经诱导的菌无　　此蛋白带。　　【实验步骤】：　　1.配制LB和LK培养基　　2.连接：质粒片断＋目的基因，16℃水浴过夜，65℃水浴10min，灭火连接酶。　　ddH2O12ulX-DNA(目的基因）3ul　　pET-28a2ul　　10×buffer2ulT4ligase1ul　　3.复苏DH5a和BL21，并接种DH5a1支，接种BL211支于试管，第二天7：30分别转接DH5a和BL21于烧瓶。　　和BL21感受态细胞的制备：在烧瓶孵育后，取菌液至离心管，4000rmp，5min，弃上清，加500ul100mmol/lCaCl2，混匀，离心4000rmp，5min，弃上清，加500ul100mmol/lCaCl2，混匀，冰浴30min，离心，弃上清。加100ul100mmol/lCaCl2,重新悬浮沉淀。　　5.转化：另取离心管，加连接反应液20ul，再加50ulDH5a和BL21感受态细菌，混匀，冰浴30min。42℃水浴90s，再冰浴　　1-2min。加500ulLB，37℃摇床培养1h。5000rpm,离心3分钟倒上清，重悬沉淀。　　6.涂板，37度过夜培养　　7.　　8．质粒提取-碱裂解法　　9.质粒酶切反应：在离心管中加入以下物质，充分混匀后，瞬时离心，37度保温1-2小时　　10.琼脂糖凝胶电泳：溶胶，稍冷却后倒胶，加样，电泳　　过程　　①配胶　　凝胶过滤法分离蛋白质　　一、实验目的　　了解凝胶层析的基本原理，并学会用凝胶层析分离纯化蛋白质。　　二、实验原理　　凝胶过滤其基本原理是利用被分离的分子大小不同及固定相具有分子筛的特点：本实验使用交联葡聚凝胶，其具有一定孔径的网络结构。高亲水，在水溶液里吸水可膨胀。当其填充完成后，加入混合分子大小不同的分离液。由于大分子物质只能沿着胶粒之间的间隙向下流动，所经路短，最先流出；而涌入胶粒内部的小分子物质，受迷宫效应的影响，要经过层层扩散向下流动，所经路程长，最后流出，通透性居中的分子则后于大分子而先于小分子流出。从而按大到小的顺序流出实现分离的目的。　　三、试剂与仪器　　/L磷酸缓冲液，%K3Fe(CN)6,交联葡聚凝胶，鸡的抗凝全血　　*20cm的层析柱，试管，量筒，大烧杯，玻璃棒　　四、实验步骤　　1.凝胶溶胀　　2.装柱：从层析柱加入缓冲液，打开出口，将气泡赶走，关闭下端开口，然后加入约6cm的缓冲液，灌注凝胶，打开下端开口。使其自然沉降高度约17cm，并使其床面覆盖缓冲液，关闭出口盖上小形圆形滤纸。待凝胶形成后，再用缓冲液洗脱2~3次。　　3.样品处理　　4.上样和过滤：吸取约混合液，在距离床面1mm处沿管内壁轻轻加入样品。打开出口，让样品溶液慢慢浸入凝胶内。凝胶柱面加上一层磷酸盐缓冲液，并用1~2倍体积的此缓冲洗脱。　　5.部分收集：控制速度为/min左右，用试管收集洗脱液。并观察柱上的色带，待黄色　　蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化在生物化学等研究应用中广泛使用，是一项重要的操作技术。蛋白纯化的基本原则,就是要利用不同蛋白间内在的相似性与差异。利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。因为每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异采用不同的方法可以把蛋白质提纯出来。　　蛋白质的分离纯化一般程序可以分为前处理、粗分级分离、细分