分子生物学试验基本技术.PPT

Molecular Biology Timeline * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 5.电渗 在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗（electro-osmosis）。其产生的原因是固体支持物多孔，且带有可解离的化学基团，因此常吸附溶液中的正离子或负离子，使溶液相对带负电或正电。 如以滤纸作支持物时，纸上纤维素吸附OH-带负电荷，与纸接触的水溶液因产生H3O+，带正电荷移向负极，若质点原来在电场中移向负极，结果质点的表现速度比其固有速度要快，若质点原来移向正极，表现速度比其固有速度要慢，可见应尽可能选择低电渗作用的支持物以减少电渗的影响。 琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围 琼脂糖凝胶浓度 线形DNA的最佳分辨范围（bp） 0.5% 1,000～30,000 0.7% 800 ～12,000 1.0% 500 ～10,000 1.2% 400 ～7,000 1.5% 200 ～3,000 2.0% 50 ～2,000 DNA片段长度 Agarose浓度使用 Marker种类 200 bp以下 3%以上 DNA Marker DL2,000DNA Marker DL2,000 + 15,000100 bp DNA Ladder Marker 200 bp～700bp 2%～3% DNA Marker DL2,000DNA Marker DL2,000 + 15,000100 bp DNA Ladder Marker 700 bp～1,500 bp 1%～2% λ-EcoT14 I digestDNA Marker DL2,000DNA Marker DL2,000 + 15,000100 bp DNA Ladder Marker 1,500 bp～5,000 bp 0.7%～1% λ-EcoT14 I digestλHind III digestDNA Marker DL15,000DNA Marker DL2,000 + 15,000 5,000 bp以上 0.7%以下 λ-EcoT14 I digestλHind III digestDNA Marker DL15,000DNA Marker DL2,000 + 15,000 四、 核酸定量技术 原理 A=㏒10（1/T）=-log(I/I0)=abc a：消光系数、c：物质浓度、b：介质长度 浓度： dsDNA: 1A260=0.05ug/ul ssDNA和RNA: 1A260=0.04ug/ul 引物: 1A260≈0.033ug/ul 寡核苷酸： 1A260≈0.02ug/ul 纯度： A260/A280 = 1.6～1.8 A260/A230 2.0 A260/A280 1.7， 蛋白质过高 A260/A280 2.0， RNA过高 A260/A280 =1.8～2.0, 盐过多 五、 分子杂交技术 六、 序列分析技术 常用DNA分子量标准 思 考 题 1. 市售苯酚为什么要饱和与重蒸？ 2. 离心操作应该注意哪些问题？ 3. 如果要分离470bp和5kb DNA 应该选择什么凝胶？ 4. 在DNA定量时，取10uL DNA待测液， 用TE buffer 稀释到100uL 后，加入到 0.5cm的石英比色皿中。A260测定为 0.21，问DNA待测液的浓度是多少？ 5. 简述DNA序列分析的基本原理。 * * * * * * * * * * * * * 医学分子生物学实验 基本技术 金光辉、李炜、郑红花、宋刚、 石松林、刘迎福 章喻军、林筱 DNA discovered by F. Meischer 1869 1910 Genes on chromosomes; T.H. Morgan 1941 One gene-one enzyme, Beadle Tatum 1944 DNA is genetic material; Avery, Mcleod McCarty 1953 Structure of DNA; Watson, Crick, Franklin, Wilkins 1961 Discovery of mRNA; Brenner,