分子试验设计.DOC

分子实验设计 ——绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达 张评瑜2013141241157 田晓震 2013141241097 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。 EGFP（Enhanced GFP)即增强型绿色荧光蛋白，它的27k Da的单体由238个氨基酸构成，本身就是一个生物发光系统，附带有激发后能发射生物荧光的发光色基。其发光过程不同于其它生物发光组织，是不需荧光素酶参与的。在紫外光激发下可发绿色荧光，常用作信号蛋白或报告基因。将目的基因与EGFP基因插入载体重组表达后，可形成融合蛋白。通过荧光显微镜、共聚焦显微镜或紫外灯观察，可直接在活细胞中检测其荧光信号，简易方便地定性检测目的基因的表达，以及进一步研究目的蛋白的定位与动态过程。 实验步骤：目的基因的获取——基因表达载体的构建——转化——目的基因筛选与鉴定 1、首先对所给的质粒进行转化，再在大肠杆菌中扩增培养。具体转化步骤见步骤三 质粒DNA的提取及琼脂糖电泳检测 1.1质粒DNA的提取 1.1.2方法：碱裂解法 1.1.3原理： pEGFP-N3质粒是一个用于在哺乳动物细胞系中表达EGFP融合蛋白的质粒，它编码了EGFP蛋白，是野生型绿色荧光蛋白（wtGFP）经技术改造而成的遗传突变体;pet原核表达质粒是最有效的原核表达系统之一。 目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译信号控制；表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。宿主菌带有受lacUV5控制的T7RNA聚合酶基因，可以通过IPTG来启动表达。充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50％以上。 分离质粒DNA的方法一般包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增、收集和裂解细菌、分离和纯化质粒DNA。50mmol/L 葡萄糖、10mmol/ EDTA-Na、25mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 分散细胞，其中螯合金属离子使酶失活，防止DNA的降解；0.4mol/L NaOH 和2% SDS临用前1：1配制，使细胞裂解，蛋白质与染色体DNA发生变性；60ml 5mol/L 醋酸钾、 11.5ml冰醋酸 、28.5ml 双蒸水 使DNA在酸性条件下复性，留在上清液，大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS复合物等发生沉淀。 1.1.4实验用品： 1.1.4.1仪器：恒温摇床，高压灭菌锅，超净工作台，10、100、1000μL微量移液器各一支，台式高速离心机，制冰机，混合漩涡器。 1.1.4.2材料: 含质粒pET-28a和pEGFP-N3菌液、.5ml塑料离心管、EP管架、微量取液器和取液器吸头、常用玻璃器皿（如三角瓶、量筒、试剂瓶）等 1.1.4.3试剂：LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，NaCl 5g，琼脂（固体培养基）15g，用 1N NaOH调pH 7.5。 溶液 Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖，10mmol/ EDTA-Na，25mmol/L Tris-HCl (pH8.0) ；溶液 Ⅱ：0.4mol/L NaOH ， 2% SDS ，临用前1：1配制；溶液 Ⅲ：5mol/L 醋酸钾60ml，冰醋酸 11.5ml，双蒸水 28.5ml；卡纳霉素(50mg/mL)；抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25：24：1 ）；无水乙醇；70%乙醇 ；TE缓冲液或ddH2O 1.1.5步骤： 1.1.5.1将含pET- 28a质粒的大肠杆菌，含pEGFP-N3质粒的大肠杆菌分别接种在液体培养基中（加卡那霉素50μg/mL），37℃培养过夜。 1.1.5.2 取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm离心2min，弃上清液。 1.1.5.3 加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10 min。 1.1.5.4加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5 min。 1.1.5.5加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，盖紧后，温和颠倒3-5次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15 min。 1.1.5.610000rpm离心 5 min，取上清液于另一干净的离心管中。 1.1.5.7向上清液中加入等体积（约400μL）酚：氯仿/异戊醇（25：24:1，v/v），振荡混匀，10000rpm 离心10 min，将上清液转移至新的离心管中。 1.1.5.8加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，离心2min ,取上清液于