第三章 高效有机物降解菌的构建技术及策略.pptVIP

第三章 高效有机物降解菌的构建 技术及策略 第三章 高效有机物降解菌的构建 技术及策略 第一节 高效有机物降解菌的构建技术 一、传统分离及驯化技术 二、诱变技术 三、细胞融合技术 四、基因重组技术 五、基因工程 六、生物酶工程 第三章 高效有机物降解菌的构建技  术和策略? 第二节 高效有机物降解菌的构建策略 一、优化污染物的降解途径 1.重组互补代谢途径 2.改变污染物代谢产物流向 3.同源基因体外随机拼接 4.拓宽氧化酶的专一性 二、提高污染物生物可利用性 1.重组表面活性剂编码基因 2.重组污染物跨膜转运基因 三、增强细菌的环境适应性 1.增强细菌的抗毒能力 2.增强细菌的放射线耐受性 第一节 高效有机物降解菌的构建技术 一、传统分离及驯化技术 不经人工诱变，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育或自然分离。 微生物自然突变有两种原因： (1)自然环境中存在的低剂量的宇宙射线、各种短波辐射、低浓度的诱变物质和微生物自身代谢产生诱变物质的作用引起的突变； （2）在DNA的复制过程中所发生的错配。 一、传统分离及驯化技术 来源：土壤、水、空气、动植物极其腐败残体、有机物污染地区。 采样 增殖培养 纯种分离 筛选 性能鉴定 一、传统分离及驯化技术 采样：应根据筛选的目的、微生物分布情况、菌种的主要特征极其生态关系等因素，确定具体时间、地点和目标物。 增殖：为提高分离效率，常以投其所好的原则在培养基中添加特殊的养分，使其所须菌种的数量相对增加。主要是利用不同微生物的生长繁殖对环境和培养基的特殊要求进行富集培养和要求，控制这些条件使之有利于某类和某种微生物，而对其它微生物不利，再对培养时间加以控制，可以达到初步的分离和富集目的。 一、传统分离及驯化技术 纯化：1.菌落纯 2.菌株纯 1.菌落纯：从“种”的水平来说是纯的，其方法有划线分离法、涂布分离法和稀释分离法。 2.菌株纯：较为精细的单孢子或单细胞分离法。 性能鉴定：菌的生长情况、酶活测定、效果测定 自然选育是一种简便易行的选育方法。但自然选育的效率低（10-8—10-10）。 二、诱变育种 诱变育种是人为地利用物理、化学等因素，使诱变的细胞内遗传物质染色体或DNA的片段发生缺失、易位、倒位、重复等畸变，或DNA的某一部位发生改变(又称点突变)，从而使微生物的遗传物质DNA或其化学结构发生变化，引起微生物的遗传变异。因此，诱发突变的频率远大于自然突变。 诱变过程 出发菌株的选择： 1.选择纯种作为出发菌株，借以排除异核体或异质体的影响； 2.不仅效果好，而且要考虑其它形状，如生长快、营养要求低等； 3.对诱变剂敏感的菌株； 4.选择已经诱变过的菌株。 诱变剂的选择（物理：紫外线、X射线等，化学：碱基类似物，5-氟尿嘧啶；烷化剂，亚硝基胍，甲基磺酸乙酯）要考虑诱变剂本身的特点，如紫外线作用于DNA分子的嘧啶碱基，而亚硝酸主要作用于DNA分子的嘌呤碱基，两者复合使用，突变谱宽，效果较好。 诱变过程 影响诱变效果的因素： 菌种的生理状态：对分裂中的细胞更有效； 细胞悬浮液要求生理状态一致，为分散均匀的单细胞或单孢子悬浮液（一方面分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，另一方面可避免长出不纯菌落）。 分离性表型延迟现象：发生变异与变异表现出来之间的相隔若干世代的现象。对霉菌多采用分生孢子或孢囊孢子进行诱变处理。 诱变过程 诱变剂的剂量：诱变率随诱变剂量的增加而提高，但达到一定程度后，再提高剂量，反而会使诱变率下降，使负变异株多，因此，主张用中等剂量，如75%-80%或更低剂量。 充分利用复合处理的协同效应。复合处理可以将两种或多种诱变剂分先后或同时使用，也可以用同一诱变剂重复使用。复合处理可扩大突变的位点范围，使获得正突变菌株的可能性增大。 筛选过程 特点：发生频率低；随机性大 过程：先初筛，后复筛，测突变菌株性能 诱变育种的基本筛选程序： 出发菌株→绝大多数个体死亡，少数存活（存活率）→少数突变（突变率）→少数正变（正变率）→少数降解酶活增加幅度大（增加率）且要求稳定 三. 原生