第十七章 液相色谱法1.pptVIP

第十七章 高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC) 概述 以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术 基础上建立的一种液相色谱法。 特点：高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离。 HPLC与经典LC区别 主要区别：固定相差别、输液设备、检测手段 经典LC 一种分离手段 HPLC 分离和分析手段 柱内径1~3cm，固定相粒径100μm 且不均匀 柱内径2~6mm，固定相粒径10μm（球形，匀浆装柱） 常压输送流动相，柱效低 （H↑，n↓） 高压输送流动相，柱效高 （H↓，n↑） 分离周期长 分离分析时间大大缩短 无法在线检测 可以在线检测 HPLC与GC差别 分析对象的差别和流动相的差别 GC HPLC 分析对象 能气化、热稳定性好、 且沸点较低的样品。 高沸点、挥发性差、热 稳定性差、离子型及高 聚物的样品不可检测 占有机物的20% 溶解后能制成溶液的样品。 不受样品挥发性和热稳定性的限制分子 量大、难气化、热稳定性差及高分子和 离子型样品均可检测。 用途广泛，占有机物的80% 流动相差别 流动相为惰性气体 与组分无亲合作用力 流动相为液体流动相 与组分间有亲合作用力，为提高柱的选 择性、改善分离度增加了因素 流动相种类较多，选择余地广； 流动相极性和pH值的选择也对分离 起到重要作用。 选用不同比例的两种或两种以上液体作 为流动相可以增大分离选择性 操作条件差别 加温操作 室温；高压（液体粘度大，峰展宽小） 相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 第一节 HPLC流程及主要部件 高压输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 附属装置：梯度洗脱、在线脱气、自动进样、组分收集、数据采集记录 一、高压输液系统高压输液系统由贮液罐、高压输液泵、梯度洗脱装置和脱气装置等部件组成。1.贮液罐 用于贮存流动相。2.高压输液泵 以稳定的流速或压力将流动相输送到色谱系统。  分为恒压泵和恒流泵两种：恒压泵 保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而变化。恒流泵 能给出恒定流量的泵，其流量与外界阻力无关，体积小，适合于梯度洗脱。又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。  3. 梯度洗脱装置 在分离过程中通过改变流动相组成以改善分离（两种或以上溶剂按一定比例混合进行二元或以上进行梯度洗脱，可以以线性、指数型或阶梯型形式） 外梯度: （低压梯度） 先将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后加压进入色谱柱。 内梯度: （高压梯度） 多台高压泵, 通过比例调节阀将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。 梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品 中各组分的分配比k’值，使所有谱带都以最佳平均分配比k’值通 过色谱柱。类似于气相色谱中的程序升温，所不同的是溶质k’值的 变化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是改变 温度（温度程序）。 A B A B C C 通过两个输液泵流速的变化，改变流动相的洗脱能力，其作用与气相色谱的程序升温类似。优点在于：改善峰形、提高柱效、缩短分析时间。 4.脱气装置流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。气泡进入检测器后会增加噪声。小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，大气泡进入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速不稳定，致使基线起伏。 一旦进入色谱柱，排出这些气泡则很费时间。在荧光检测中,溶解氧还会使荧光淬灭。溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液pH值发生变化。 超声波脱气： 将配制好的流动相连容器放入超声水槽中脱气10-20min。这种方法比较简便，又基本上能满足日常分析操作的要求，所以，目前仍广泛采用。吹扫脱气： 将气源（钢瓶）中的气体（氦气）缓慢而均匀地通入储液罐中的流动相中，氦气分子将其它气体分子置换和顶替出去，而它本身在溶剂中的溶解度又很小，微量氦气所形成的小气泡对检测无影响。 二、进样系统将分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。 高效液相色谱柱短（约5～30cm），柱外展宽（柱外效应）突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起往前展宽的主要因素。 高效液相色谱法中对进样系统要求：密封性好，死体积小，重复性好，进样时引起色谱系统的压力和流量波动要很小。 通常使用耐高压的六通阀进样装置示意图