马传染性贫血病毒核壳蛋白的表达纯化和性质研究-微生物专业毕业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所 取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包 含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所 涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名： 安婧 2015 年 5 月 21 日 非公开学位论文标注说明 (本页表中填写内容须打印) 根据南开大学有关规定，非公开学位论文须经指导教师同意、作者本人申 请和相关部门批准方能标注。未经批准的均为公开学位论文，公开学位论文本 说明为空白。 论文题目 申请密级 □限制(≤2 年) □秘密(≤10 年) □机密(≤20 年) 保密期限 20 年 月 日至 20 年 月 日 审批表编号 批准日期 20 年 月 日 南开大学学位评定委员会办公室盖章(有效) 注：限制★2 年(可少于 2 年);秘密★10 年(可少于 10 年);机密★20 年(可少于 20 年) 摘要 摘要 摘要 马传染性贫血病毒（equine infectious anemia virus, EIAV）作为逆转录病毒 中的慢病毒家族中的一员，具有结构简单，与人免疫缺陷病毒基因组同源性高、 形态和生活周期相似等特点，因此可以作为研究慢病毒的理想模型。Gag 蛋白由 病毒 gag 基因编码，先翻译成多聚蛋白前体，在病毒成熟过程中被病毒编码的 蛋白酶裂解为基质蛋白、衣壳蛋白、核壳蛋白（nucleocapside protein, NCp11） 和 C 端小肽 p9。在病毒颗粒的组装中 Gag 与 RNA 之间特异的与非特异的相互 结合起着至关重要的作用。NCp11 不但赋予了 Gag 蛋白与核酸作用的能力，而 且在病毒颗粒的装配中介导了 RNA 的选择性包装和再折叠。因此对 NCp11 的研 究可以更为清楚地了解病毒颗粒的包装原理以及相关机制。 本文首先利用镍亲和层析的方法从大肠杆菌中纯化了带 His 标签的 NCp11， Gag 以及 Gag 加工过程中的中间产物 NCp11-p9，经 SDS检测，得到了纯 度较高的重组蛋白。随后的琼脂糖凝胶电泳发现，经镍亲和层析纯化的 NCp11、 NCp11-p9 和 Gag 均为蛋白－核酸复合物，而用同样方法纯化的 p9 中则检测不 到核酸信号。对所纯化的三种蛋白－核酸复合物进行了性质分析，发现它们对 RNase A 消化和脱氧胆酸钠处理敏感，而对热处理和 Tween 20、Triton X-100 和 NP40 处理不敏感。然后，本文制备了不含核酸的 NCp11、NCp11-p9 和 Gag 蛋 白，证实它们能以序列非特异性的方式在体外结合 RNA 和长度不同的 DNA。 本文还用质谱的方法鉴定了 NCp11-p9 的 SUMO 化修饰位点，检测到 4 个被 SUMO 化修饰的 NCp11-p9 分支片段，发现 SUMO 化修饰影响 NCp11-p9 结合 RNA 的能力。上述结果不仅为研究 EIAV Gag 和 NCp11 与 RNA 的相互作用积累 了数据，还提示我们，对于序列非特异性的核酸结合蛋白，通过镍亲和层析纯 化、经 SDS检测被认为是纯度较高的蛋白质，也有可能是蛋白－核酸复 合物。 关键词：马传染性贫血病毒；核壳蛋白；Gag；RNA 结合蛋白 I Abst Abstract Abstract As a member of lentivirus in retrovirus, Equine Infections Anemia Viru（s EIAV） has a simple structure, and high homology with human immunodeficiency virus genome, and similar morphology and life cycle. So EIAV can be used as a model system of studying lentivirus. Gag proteins are encoded by gag gene. In the beginning, Gag protein is translated into pre-polyprotein. During the maturation process , pre-polyprotein splits into MAp15, CAp26, NCp11 and p9 by viral-coded protease. In the assembly of virus particles, the specifi