绿僵菌侵染蝗虫差异糖蛋白及其酪氨酸蛋白磷酸酶在寄主血淋巴中的靶标蛋白分析-生物医学工程专业毕业论文.docxVIP

③病原真菌侵染的前 4d，血淋巴总蛋白 SDS表达谱没有明显变化，而 在感染后第 6d，昆虫血淋巴蛋白谱发生了显著变化，感染昆虫血淋巴较对照明显 新增了 3 条蛋白谱带，1 条蛋白谱带较对照明显减弱。 ④用 Con A-Sepharose 4B 分离纯化蝗虫血淋巴糖蛋白，通过对照与感病昆虫 血淋巴糖蛋白双向电泳图谱比较分析，筛选出 13 个差异表达糖蛋白点，其中 9 个 表达水平发生上调，4 个蛋白表达下调。 ⑤用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)获得了 10 个差异 蛋白的清晰肽质量指纹图谱(Peptide Mass Fingerprinting, PMF)。但由于东亚飞蝗蛋 白基因组和蛋白质序列信息量较少，这些肽质量指纹数据均未能通过 MASCOT 搜 索引擎在 NCBI 数据库中搜索到显著差异的检索结果。 ⑥通过质谱肽段 de novo 测序，获得了 4 个差异蛋白的 13 个肽段氨基酸序列， 用 生 物 信 息 学 方 法 ， 其 中 的 3 个 被 鉴 定 为 transferrin （ SGLDDVLSLDGGEALTAVR ） ， Apolipophorin precursor protein （EIVAEGLLIDDNNEK）和 hexamerin storage protein（YDAYGNEMTLDEAR）。 已有的研究资料表明，transferrin 和 hexamerin storage protein 两个蛋白与昆虫的免 疫反应有关。其它 10 个差异表达糖蛋白仍为未知蛋白。 ⑦将蝗虫血淋巴用磷酸化蛋白亲和层析后得到的磷酸化蛋白用纯化的绿僵菌 PTPase 作用，作用后的蛋白样品经双向电泳比较分析得到两个差异点。这两个蛋 白点用串联质谱分析后比对发现其中一点与 Toll-like receptor 同源性好，而 Toll-like receptor 是介导昆虫产生免疫反应信号传导物质，暗示该磷酸酶具有干扰蝗虫体内 信号传导的能力。另一点与 Golgi autoantigen ，golgin subfamily A member 4 (Trans-Golgi p230)同源性好，而该类蛋白与动物的自身免疫疾病和有些蛋白特别是 糖蛋白从高尔基体的外运有关，暗示该磷酸酶可能通过对该蛋白去磷酸化，阻碍 某些糖蛋白的外运，尤其是某些重要的免疫糖蛋白，降低昆虫的免疫力。 关键词：东亚飞蝗，金龟子绿僵菌，糖蛋白，磷酸化蛋白，蛋白酪氨酸磷酸酶 ABSTRACT Metarhizium anisopliae, a kind of entomopathogenic fungus widely applied at home and abroad, plays an important role in biological control of locusta migratoria. Compared with chemical insecticides, mycoinsecticides are not infective or toxic to human and have no environmental pollution, but the slow insecticidal speed has been recognized as a potential drawback to prevent the utilization of these fungi against insects. Researches on the interactions between pathogenic fungi and locusta migratoria, exploring the mechanisms of fungal pathogenesis and host defense may suggest strategies for the development of more efficient anti-insect mycoinsecticides. During the period from the pathogenic fungi getting into the haemocoel of insects to the moment the insects die, there happen complicated interactions between pathogens and their hosts. On the one hand, fungi suppress the defensive responses of the host cells by relasing