分子生物学试验.PDF

分子生物学实验 PCR 扩增目的基因 实验目的： (1)PCR 扩增目的基因红细胞生成因子 nap 基因 部分片段； (2)掌握 PCR 扩增原理； (3)学习并熟悉 PCR 操作 实验原理: PCR 实际上是 DNA 体外的快速扩增技术，类似 DNA 的细胞内复制过程。 由一对引物介导,通过温度的调节，使双链 DNA 变性为单链 DNA 、单链DNA 能与引物复性（退火）成为引物-DNA 单链复合物、以及在 dNTPs 存在下 DNA 聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链 DNA （引物的延伸）。 这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个PCR循环；一般通过 20-30 个循环 6 之后，就可获得大量（10 倍）的要扩增的DNA片段。 通常又称为无细胞分子克隆技术、基因扩增技术或 DNA 扩增技术。 1 实验步骤: 1.配制 PCR 反应体系(总体系 50μl) ： 10X PCR Buffer 5 dNTP 4 Primer F 2 Primer R 2 Template 1 Taq 1 H O 35 2 2.设置 PCR 反应程序: 95 ℃ 5min 94 ℃ 30 sec 55 ℃ 30sec 33cycles 72 ℃ 30sec 72 ℃ 5min 实验结果与讨论： 实验结束以后，琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增结果，在 500bp 左右，如有 明显扩增条带，说明PCR 成功。 2 细胞生物学实验 密度梯度离心法提取叶绿体 一、实验原理 用低温研磨的方法将植物组织、细胞破碎，细胞内不同的组分游离在酸碱度 和渗透压与亲体状态下均接近的匀浆介质中。将上述含细胞不同组分的匀浆介质 加入到预先铺制好的蔗糖密度梯度介质中，低温高速离心后，在离心力的作用下， 沉降系数不同的组分，就会出现在离心管内不同的位置，达到分离、制备的目的。 二、目的和要求 通过此试验，使学生学习密度梯度离心法提取植物叶绿体的技术，巩固掌握 非染色法观察细胞器的方法。 三、实验材料 新鲜菠菜叶子。 四、实验器材 研钵、普通离心机、高速冷冻离心机、离心管、烧杯、漏斗、纱布、载玻片、 盖玻片、显微镜、剪刀、移液枪、滴管。 五、药品及试剂配制 蔗糖、三羟甲基甲胺（Tris ）、HCl 。 匀浆介质（0.5M 蔗糖、0.05M Tris-HCl 缓冲液 PH7.4 ）：称 85.55 克蔗糖、 6.05 克 Tris，溶解在近 800 毫升蒸馏水中，加入 4.25 毫升 0.2NHCl，加蒸馏水到 100 毫升。 六、实验步骤 1.洗净菠菜叶，尽可能使它干燥，去除叶柄、主脉后，称取 50 克，剪碎。 2.加入预冷到接近 0℃的匀浆介质200 毫升，高速捣碎 2 分钟。 3.用双层纱布过滤。 4.滤液 500rpm 离心 5 分钟，去沉淀。 5.在离心管内依次加入 50