绿僵菌致病相关基因Mzbot的克隆和功能研究-生物学专业毕业论文.docxVIP

Cloning and Functional Analysis of the Pathogenic Related gene Mzbot in Metarhizium anisopliae A Thesis Submitted to Chongqing University in Partial Fulfillment of the Requirement for the Degree of Master of Science By Mingjing Gao Supervised by Prof. Yuxian Xia Major: Biology College of Bioengineering of Chongqing University, Chongqing, China December, 2011 中文摘要 中文摘要 重庆大学硕士学位论文 重庆大学硕士学位论文 I I PAGE PAGE IV 摘 要 绿僵菌（Metarhizium anisopliae）又名黑僵菌，是一种常见的丝状真菌，有着 广泛的地理分布，也是国内外生物防治中应用广泛的昆虫病原真菌之一。绿僵菌 具有一定的专一性，对人畜无害，同时还具有不污染环境、无残留、害虫不会产 生抗药性等优点。随着绿僵菌基因组测序的完成，使其更成为一种研究虫生真菌 的模式生物。迄今，关于真菌的致病机制的研究广泛，而关于虫生真菌致病相关 基因的研究亦十分活跃。这是由于绿僵菌致病力弱，货架期短，环境依赖性强严 重制约了绿僵菌杀虫真菌农药的发展。致病基因、耐胁迫基因的研究将为菌株改 造提供基因资源。 本实验从绿僵菌 CQMa102 在蝗虫翅膀生长时期与在蝗虫体内生长时期的差 减 cDNA 文库中选取了一个高表达基因 EST 序列，WTEA78。根据这个 EST 序列， 我们从绿僵菌全长 cDNA 文库中克隆了这个基因 Mzbot，该基因 cDNA 序列全长 1251bp， 与费希新萨托菌的 zinc-binding oxidoreductase ToxD 基因具有较高的同源 性，同时利用 RNAi 和超表达的方法，通过减少或增加基因的表达量后绿僵菌变异 表型，研究了 Mzbot 的功能。得到的主要实验结果如下： 1．绿僵菌 Mzbot 基因的克隆、序列分析和表达情况 克隆了蝗虫翅膀上特异高表达基因 Mzbot 的 cDNA 全长，进行了生物信息分 析，并通过 RT-PCR 对其侵染蝗虫过程中的表达模式进行了分析。 Mzbot 基因 cDNA 片段全长 1251bp，包括一个 1089bp 的开放阅读框，69bp 的 5’非翻译区，93bp 的 3’非翻译区。该 cDNA 序列的 Genebank accession number 为 HQ011919。与绿僵菌 CQMa102 全基因组序列比对，获取了 Mzbot 基因的基因 组 DNA 序列。将 DNA 序列与 cDNA 序列用 DNAMAN 软件比对，结果表明：Mzbot 基因组 DNA 全长 1478bp，含有 4 个外显子和 3 个内含子，内含子位置为 （283bp-381bp、661bp-715bp、800bp-866bp），其边界皆符合 GT-AG 规则。 在线预测该基因编码 362 个氨基酸，预测蛋白质分子量 Mw=39336.81u （当 Cys 处 于 还 原 状 态 时 ）； 理 论 等 电 点 pI=5.41 属 于 酸 性 蛋 白 质 ； 其 分 子 式 为 C1786H2772N456O530S7；负电荷残基 (Asp + Glu) 47 个，正电荷残基(Arg + Lys)39 个， 平均亲水性(GRAVY): -0.135，是一个亲水蛋白；不稳定指数(Instability index )19.67， 为稳定的蛋白质。同费希新萨托菌的 zinc-binding oxidoreductase ToxD 基因具有较 高的同源性（51 % identity，E-Value 值为 6e-85）。与其他真菌已知或推测的 zinc-binding oxidoreductase ToxD 也有较高的同源性。在线分析推测编码蛋白不含 有信号肽，没有定向到线粒体的导肽，也没有核定位信号 Nuclear Localization Signals (NLS)，定位在细胞质。 生物信息学预测表明该蛋白没有显著的跨膜结构区域，这与生物信息学定位 一致，在 163 位氨基酸处（NKTV）有一个 N-糖基化位点(N-glycosylation site)；在 12 与 223 位氨基酸处（RKAT）各有一个 cAMP- 与 cGMP-依赖的蛋白激酶磷酸 化位点；在 195、242、251